论文部分内容阅读
p53基因是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因。前人研究表明, p53基因行使其生物学效应主要是通过P53蛋白与特异基因组序列结合,激活下游基因转录、作用来实现的。因此,鉴定p53下游基因是了解p53基因调控网络的关键。本实验室在前期工作中建立携带野生型p53转基因的U251-pTet-p53细胞系,在四环素应答元件的控制下,诱导p53基因表达。通过差异显示技术,克隆到一个新的P53下游基因候选基因——PAP1基因。本文构建了pET28b-p53重组表达质粒,将pET28b-p53转化到大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达P53蛋白。用地高辛标记PAP1基因作为探针,与P53蛋白做凝胶滞留实验,鉴定P53蛋白下游候选基因PAP1。然后综合运用生物信息学方法对PAP1基因进行了基因结构分析和功能分析。研究结果显示:(1)该基因序列能与野生型P53蛋白结合,与突变型P53蛋白几乎不结合。因此PAP1基因是P53蛋白的下游基因,受P53蛋白调控。(2)PAP1基因定位于人类染色体16p12-13上,PAP1蛋白分子量为32.9KD,理论等电点pI为5.81,化学方程式为C1505H2309N385O421S11,半衰期为30小时左右,不稳定指数:42.58,脂肪族指数Aliphatic index:95.64,总平均疏水性:-0.162。PAP1蛋白为亲水性蛋白,存在一个跨膜区,大约在42-79氨基酸片段,没有信号肽。(3)PAP1基因属于DREV1转甲基酶基因家族。PAP1mRNA对GenBank数据库进行相似性搜索-BLASTN,与DREV1基因的相似性很高,将它们进一步做双序列比对发现它们的相似性在80.8%,除了在开头和结尾的相似性很差之外,其它部分相似性较高。PAP1与DREV1,CD4,TCRα、β、γ多序列比对时,存在几个保守的位点。PAP1与各个物种的同源基因的多序列比对,它们的保守性很高。(4)PAP1蛋白的二级结构为混合型,40%为α螺旋,17%为β折叠,43%为其它类型的二级结构;含有DREV1转甲基酶结构域,同时PAP1蛋白也存在N-糖基化位点,蛋白酶C磷酸化位点,干酪素蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,N-十四酰基化位点,酪氨算盐酸化作用位点。(5)与老鼠IGSF6基因同源性较高,可能是同源基因。IGSF6基因在老鼠胚胎发育中起着重要作用,依此推测PAP1基因也可能在人的胚胎发育中起着重要的作用。