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精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）是位于睾丸曲细精管基底膜上,主要参与精子发生过程。它通过自我更新维持生殖干细胞库稳定或是自我分化成一定数量的精母细胞并最终发育成精子,保证雄性动物正常的生殖能力。SSCs是雄性动物中唯一能将遗传信息传递给后代的干细胞,具有很强的可塑性,不但能体外培养建系或建立其长期培养系统,将会极大地促进精原干细胞移植、转基因等技术的实际应用,而且会给体外研究细胞的发育分化提供很好的材料。研究人员培育转基因动物的主要方法是在动物早期胚胎或细胞中植入所设计的基因,但禽类为卵生动物,禽类的SSCs在生产转基因鸡和保存濒危物种的遗传资源中具有广阔的应用前景,而建立一个能使禽类SSCs有效增殖和传代的体外培养系统是这些应用的前体条件。本研究内容分5个部分:试验一:不同日龄怀乡鸡睾丸组织的精原干细胞多能性未分化特异性标记基因表达特性取6个不同时期（8d龄、21d龄、31d龄、45d龄、58d龄、79d龄）怀乡鸡公鸡各5只,1只怀乡鸡睾丸组织用于制作组织学切片及白片免疫荧光染色;4只怀乡鸡睾丸组织qPCR法测定睾丸组织中Gfra1、CD90、OCT4 m RNA的相对表达量。结果显示:（1）伴随着个体发育,SSCs从生精小管中间部逐渐向基底膜迁移。怀乡鸡日龄增大,睾丸内的细胞逐渐分化到后期细胞,SSCs阳性细胞数减少。（2）qPCR检测不同日龄睾丸组织的精原干细胞多能性未分化特异性标记基因的表达结果表明随着怀乡鸡日龄的增大,睾丸组织中特异性标记基因Gfra1、CD90、OCT4 m RNA表达量逐渐降低,SSCs阳性细胞数量相对减少,成年后鸡睾丸组织中SSCs仍然存在,但含量减少明显,SSCs的体外分离效率降低。雏鸡日龄越小SSCs阳性细胞数越多,选取21d龄为后续SSCs分离日龄。（3）怀乡鸡睾丸组织石蜡切片免疫荧光染色显示Gfra1和CD90阳性。试验二:不同日龄对睾丸组织分离获得精原干细胞效率的影响（1）三酶两步消化法（1mg/m LⅣ型胶原酶与30μg/m L Dnase酶+0.125g胰酶+0.02g EDTA）处理6个不同时期怀乡鸡睾丸组织,21d龄所获细胞总数为3.37×106,与之相比,8d、31d、45d细胞总数分别降低了29.37%、32.64%、24.63%（P<0.01）;58d、79d日龄细胞总数分别升高了47.99%、48.63%（P<0.01）。8d、21d、31d、45d龄细胞存活率间无显著差异（P>0.05）,与之相比,58d龄细胞存活率分别降低7.38%、8.86%、6.23%、7.06%（P<0.05）;79d龄细胞细胞存活率分别降低9.09%、10.54%、7.97%、8.78%（P<0.05）。说明怀乡鸡日龄越大,睾丸组织越大,分离出的细胞总数增多,但完全消化睾丸组织所需时间变长,导致消化过度细胞存活率降低。可知最适分离精原干细胞的日龄为21日龄。试验三:不同消化酶组合和不同纯化方法对鸡精原干细胞获得率、干细胞活力的影响取21日龄怀乡鸡公鸡8只,随机分为消化酶组合1组（1mg/m LⅣ型胶原酶与30μg/m L Dnase酶+0.25g胰酶+0.04g EDTA）、消化酶组合2组（1mg/m LⅣ型胶原酶与30μg/m L Dnase酶+0.125g胰酶+0.02g EDTA）,每组4个重复。血细胞计数板计数两组消化酶组合消化睾丸组织后细胞获得率,台盼蓝染色计算两组细胞活率。分离结束后,各分成三份,比较差速贴壁法、percoll密度梯度离心法及疫磁珠分选法纯化前后SSCs的效率。结果显示:（1）消化酶组合1和2每克睾丸细胞获得率平均分别为（4.25±0.9）×106、（3.22±0.89）×106（P>0.05）;消化酶组合1法细胞活率为（83±2.13）%,与之相比,消化酶组合2法细胞活率升高了16.18%（P<0.01）,说明消化酶组合2消化睾丸所获细胞活性更高,采用消化酶组合2适合分离鸡SSCs,表明低浓度组合酶（消化酶浓度2）更适合分离睾丸组织,更有利于后续细胞的培养。（2）消化酶组合2消化获得单细胞悬液,三种不同纯化方法（差速贴壁法、percoll密度梯度离心法、免疫磁珠分选法）纯化单细胞悬液,纯化效率分别为（81.19±0.16）%、（77.39±0.57）%、（49.53±0.72%）。与免疫磁珠法相比,差速贴壁法和密度梯度离心法两者纯化效率分别升高了63.92%、56.24%（P﹤0.01）。说明差速贴壁法更能富集到SSCs,在纯化效率无差异情况下,差速贴壁法相对于密度梯度离心操作更简便、快捷。总的来看,三种纯化方法中差速贴壁法更适合我们实验室纯化细胞。试验四:不同浓度血清的培养液对鸡原代精原干细胞体外增殖的影响以低浓度消化酶组合2消化睾丸组织细胞差速贴壁后收集细胞悬液,检测不同浓度血清（2%、5%、7%、10%的FBS）的四种培养液配方对鸡精原干细胞的克隆数、AKP阳性率影响、细胞免疫荧光检测SSCs标记物Gfra1和OCT4,qPCR检测SSCs关键转录因子Gfra1和OCT4的表达水平的影响。结果显示:（1）2%FBS组能明显促进精原干细胞增殖,相同时间内鸡精原干细胞的平均集落数较其他试验组差异极显著（P<0.01）,低浓度血清培养是鸡精原干细胞体外增殖所必要的。（2）聚集成团的葡萄状细胞集落AKP染色显示为阳性且免疫荧光染色Gfra1、CD90均呈阳性,表明Gfra1、CD90为SSCs特异性标志基因,与睾丸组织中SSCs表达Gfra1、CD90相呼应。（3）SSCs关键转录因子Gfra1、CD90和OCT4 m RNA的表达水平较支持细胞差异极显著（P<0.01）,表明睾丸中只有SSCs表达Gfra1、CD90和OCT4。试验五:细胞因子（GDNF、m LIF和b FGF）对鸡原代精原干细胞体外增殖的影响CCK8法检测单因子浓度和组合因子浓度OD值。单因子实验设置五组,分别为对照组及不同浓度单因子组,每组5个重复。组合因子设置20组（见实验分组）,每组5个重复。结果显示:（1）三种细胞因子在单独添加时,GDNF、b FGF、m LIF的最适浓度分别为20ng/ml、30ng/ml、5ng/ml。三种细胞因子联合添加时,低剂量时共同促进SSCs的增殖,高剂量时则抑制SSCs的增殖。推断GDNF、m LIF和b FGF的最佳作用剂量分别是5-10ng/ml、5-10ng/ml、10-20ng/ml。本试验表明用21日龄怀乡鸡公鸡睾丸组织以消化酶组合2（低浓度组）差速贴壁法最适合分离纯化SSCs,用89%DMEM+1%双抗+2%FBS+8%KSR+5.5×10-5mol/l 2-巯基乙醇+1mmol/l丙酮酸钠+2mmol/l L-谷氨酰胺+0.1mmol/l非必须氨基酸+10ng/ml GDNF+10ng/ml m LIF+20ng/ml b FGF配方有利于SSCs增殖。