论文部分内容阅读
我们此前的研究结果显示天然产物小檗碱(BBR)通过激活胞外信号调节激酶(ERK)途径来上调肝脏低密度脂蛋白受体(LDLR)的mRNA表达从而发挥降低血清胆固醇(CHO)的作用。但BBR是如何激活ERK的尚不明确。本研究旨在探索BBR激活ERK丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径的上游细胞信号通路和信号分子的作用机制。我们在信号通路的阻断实验中使用了多种化学抑制剂,如Raf-1特异性抑制剂GW5074、Ras抑制剂手霉素A(manumycin A)、蛋白激酶C(PKC)抑制剂十字孢碱和AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)特异性抑制剂compound C等,也用到了特异性的小干扰RNA (siRNAs)来沉默AMPK的表达；应用western blot来检测相关蛋白激酶的磷酸化水平；采用实时荧光定量反转录PCR (qRT-PCR)来检测LDLR mRNA的表达水平；以脂肪乳剂灌胃的方法建立了大鼠高血脂模型以研究BBR在体内对相关信号通路的作用。体外实验结果发现BBR在HL-7702细胞和HepG2细胞中均可以显著增加Raf-1的丝氨酸388(ser338)的磷酸化水平,这种作用具有时间依赖性和剂量依赖性。BBR对Ras蛋白的活性没有影响；其激活Raf-1信号通路和上调LDLR mRNA表达的作用能被GW5074所完全阻断,但不能被manumycin A所阻断。动物实验结果证实BBR在高血脂模型的大鼠体内具有激活肝脏Raf-1和上调肝脏LDLR mRNA表达的作用,但不影响肝脏的Ras活性。更为重要的是,我们的研究结果显示BBR激活Raf-1信号通路和上调LDLR mRNA表达的作用能够被compound C这一特异性的AMPK抑制剂所完全阻断,同时也能被AMPK siRNA所阻断。综上所述,我们的结果首次证明BBR在肝细胞中通过AMPK依赖的方式来激活Raf-1通路从而上调肝脏LDLR mRNA的表达,该过程与Ras途径无关。我们的研究进一步阐明了BBR降CHO的分子药理机制,为其将来在临床用于治疗高CHO血症提供了新的科学依据。本部分实验旨在探索化合物假小檗碱(Y53)这一小檗碱(BBR)类似物在糖尿病(DM)小鼠中的抗炎、抗氧化和预防糖尿病肾病(DN)的作用。首先,我们观察了Y53和BBR对正常小鼠血糖和肝、肾功能的影响。使用昆明(KM)小鼠,以Y53 100mg/kg或BBR 100mg/kg灌胃给药30天,观察动物的一般情况,实验结束后测定空腹血糖(FBG)、肝功能指标、肾功能指标并进行肝和肾的苏木精&伊红(H&E)染色,观察病理学变化。实验结果显示,Y53和BBR给药后动物一般情况良好,二者在100mg/kg这一剂量给药时对KM小鼠的FBG、体重和肝、肾功指标均无明显影响,病理结果也提示Y53和BBR对肝脏和肾脏无明显毒性。接下来,我们探索了Y53在合并脂肪肝的DM模型小鼠体内的抗氧化应激、抗炎和调节糖脂代谢的活性与机制。我们采用高脂饮食(HFD)诱导联合一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)120mg/kg的方法诱发C57BL/6J小鼠DM的发生。此后,造模成功的DM模型小鼠被分为4组,分别每天口服灌胃给予生理盐水、BBR50mg/kg、Y53 50mg/kg或是BBR 100mg/kg。实验结果显示,Y53能够显著降低DM小鼠的血脂和FBG,恢复血清胰岛素水平和胰腺重量,并显著上调肝脏低密度脂蛋白受体(LDLR)和胰岛素受体(InsR)的表达。Y53也能够显著抑制模型动物肝脏脂肪变性,减少肝脏脂质积聚,降低肝重和肝指数,恢复肝功能。DM模型组小鼠体内存在着明显的氧化应激和炎症反应。Y53可显著上调DM动物血清、肝脏和胰腺组织内超氧化物歧化酶(SOD)的活性并降低丙二醛(MDA)的水平；另一方面,Y53显著降低肝脏和胰腺组织中促炎性细胞因子如白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α) mRNA的表达水平,同时增加核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)和醌氧化还原酶-1(NQO-1) mRNA的表达水平。Y53在DM小鼠体内的抗氧化应激、抗炎和调节糖脂代谢的药效优于同剂量的BBR,几乎与两倍剂量的BBR药效相当。在另一批动物实验中,我们研究了Y53对小鼠DN的预防作用。我们采用一次性腹腔注射STZ 120mg/kg的方法诱发C57BL/6J小鼠的DM模型。之后,DM模型动物被分为4组,每天分别灌胃给予生理盐水、BBR 50mg/kg、Y53 50mg/kg或罗格列酮(ROSI) 5mg/kg。实验过程中和结束后,收集实验动物的尿液、全血、血清和肾脏组织,使用试剂盒检测相关指标。部分小鼠肾脏用于H&E染色,还使用实时荧光定量反转录-PCR (qRT-PCR)的方式检测肾脏中目的基因的mRNA表达水平。实验结果显示,Y53能够显著降低DM动物的FBG和糖化血红蛋白(GHb),改善实验动物多食和多尿等DM症状。Y53还可以显著降低血尿素氦(BUN)、血清肌酐(Scr)、24 h尿蛋白、肾指数、血清和肾脏组织的晚期糖基化终末产物(AGEs)、一氧化氮(NO)、肾脏MDA、胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)含量,并显著增加肾脏组织SOD的活力。在病理检测中,Y53可明显改善DM小鼠肾脏组织的形态学并抑制肾小球硬化。Y53能够显著降低DM小鼠肾脏中促炎性细胞因子的表达水平以及与肾脏纤维化病变相关的基因,如转化生长因子-β(TGF-β)和smad2的表达水平。本实验中Y53的肾脏保护药效明显强于BBR和ROSI。综合以上实验结果,Y53对正常小鼠的FBG没有明显影响,但能够显著改善DM小鼠的糖脂代谢,缓解炎症反应和氧化应激,并预防DN的发生,保护肾功能。我们认为Y53未来有望开发成为一个全新的口服降糖药物用于DM及其并发症如DN的治疗。