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异丁醇是一种新型清洁生物能源,具有广泛的应用前景。酿酒酵母可利用自身缬氨酸生物合成途径合成异丁醇。利用基因工程技术对酿酒酵母合成异丁醇通路中的关键基因进行过量表达或者缺失可以有效提高异丁醇的产量。随着异丁醇产量的不断增加,酿酒酵母对异丁醇的耐受性是影响异丁醇产量继续提高的关键因素之一。本文将通过化学诱变法筛选高耐受性异丁醇的酿酒酵母突变菌株,并利用基因工程技术提高突变菌株异丁醇的产量。首先利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）对酿酒酵母W303-1A进行随机诱变,确定了EMS最佳诱变浓度为40μL/mL,设定了不同的菌液稀释梯度(OD600为1,10-1,10-2,10-3,10-4),通过表型分析突变菌株对不同浓度异丁醇的耐受性。筛选得到25株在含2%异丁醇的YPD培养基上生长良好的突变菌株。将其中7株可在含3%异丁醇的YPD培养基上生长良好的突变菌株进行生长及耗糖测定,确定一株最佳突变菌株EMS39。其次为在突变菌株EMS39中过量表达异丁醇合成通路中的关键基因ILV2、ILV5、ILV3和ARO10构建了相应表达载体。其中,载体pUC18-δ5’-His-PGK1p-ILV3-δ3’是利用δ-整合技术将ILV3基因整合至菌株染色体上使其过量表达;载体YEplac181-TDH3p-Cox4-ARO10-GFP-CYC1、YEplac195-PGK1p-ILV2和YEplac112-PGK1p-ILV5-GFP-CYC1则直接转化入酿酒酵母细胞中,构建得到工程菌W303-1A V2V5V3O10和EMS39 V2V5V3O10。同时构建转入空载体的W303-1Aδ5’-His-δ3’YEplac195 YEplac181 YEplac112作为对照菌。然后对所构建工程菌进行了常规微厌氧发酵以及高密度发酵,监测了菌株生长情况和耗糖情况,并测定了发酵液中异丁醇、乙醇和乙酸含量。常规微厌氧发酵结果表明,工程菌EMS39 V2V5V3O10异丁醇产量明显高于对照菌和工程菌W303-1A V2V5V3O10。发酵32 h时工程菌EMS39 V2V5V3O10的异丁醇产量达到404.2 mg/L,产率达到10.11 mg/g葡萄糖,比对照菌提高了5.7倍,比工程菌W303-1A V2V5V3O10提高了1.5倍。工程菌W303-1A V2V5V3O10和EMS39V2V5V3O10的乙醇产量略高于对照菌,但三株菌的乙醇产量变化不大,工程菌EMS39 V2V5V3O10在发酵32 h时乙醇产量达到最高为4.343 g/L。高密度发酵结果显示,发酵24 h时工程菌EMS39 V2V5V3O10的异丁醇产量达到2.795 g/L,产率为69.9 mg/g葡萄糖,比对照菌EMS39δ5’-His-δ3’195 181 112提高了1.6倍。工程菌W303-1A V2V5V3O10的异丁醇产量32 h后显著提高并在48 h达到最高为4.206 g/L,产率达到100.6 mg/g葡萄糖,是初始对照菌W303-1Aδ5’-His-δ3’195181 112的4.1倍。此外,构建了过表达酿酒酵母异戊醇生物合成途径中五个关键基因的质粒,为后续开展异戊醇生物合成提供了研究基础。综上所述,本研究结果表明通过EMS诱变可筛选出高异丁醇耐受性的酿酒酵母突变株,且筛选得到突变株的异丁醇合成能力显著提高。这些研究为进一步提高酿酒酵母合成异丁醇的产量奠定了基础。