【研究背景】下腰痛（low back pain,LBP）是指腰骶部疼痛或不适感,伴或不伴下肢放射痛。它是我国脊柱外科门诊最常见,也是全世界发病率最高的一类骨骼肌肉系统疾病。全世界超过70%的人都经历过下腰痛。这种疾病在老年人群中更为常见,严重影响患者的生活质量,同时也给家庭和社会带来沉重负担。据报道,美国政府每年用于下腰痛的医疗开支高达500亿美元。椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IVDD）是引起下腰痛的主要原因,但椎间盘退变机制仍未完全阐明。现有治疗方案多以对症治疗为主,却无法从根本上扭转椎间盘退变发生发展的趋势,目前尚缺乏有效延缓椎间盘退变的治疗手段。因此,深入研究椎间盘退变的发生机理,进而寻找新的干预靶点及治疗药物,将对于下腰痛防治具有重要的临床价值、经济效益和社会意义。椎间盘主要由三个部分组成:外层的纤维环（annulus fibrosus,AF）、内部的髓核（nucleus pulposus,NP）、上下软骨终板（cartilage endplate,CE）。椎间盘在缓冲、转移、分散脊柱负荷,以及为脊柱提供活动性和稳定性等方面扮演着举足轻重的作用。椎间盘组织生存的微环境和体内其他组织存在显著差异,低营养供给、低pH值、低氧等均是其特点。髓核组织与最近的血管之间的距离可达8mm,导致髓核组织低氧环境的形成。髓核细胞对于无血管环境更加适应,低氧是健康椎间盘组织最为重要的理化环境。在椎间盘老化和退变的过程中,氧浓度水平的变化将激活或抑制多种稳态基因,以支持髓核细胞生存和功能调节。低氧微环境的破坏在椎间盘退变的发病机制中起重要作用。一项最新研究显示,髓核细胞在5%和21%氧浓度下合成代谢相关基因表达降低,而在1%氧浓度下增加,表明低氧是最适合髓核细胞生长、保持髓核表型的微环境。换言之,传统意义上的常氧（21%O2）对于髓核细胞则是一种高氧张力（high oxygen tension,HOT）的病理环境。另有研究表明,椎间盘内异常新生血管引起的氧张力升高与椎间盘退变的发生发展密切相关。目前的研究多集中在低氧对髓核细胞的保护机制,然而关于髓核细胞如何适应高氧张力的研究却很少。整合素（integrin,ITG）是一类由α（120～185k D）与β（90～110k D）两种亚单位形成的异源二聚体跨膜糖蛋白。目前已经发现整合素有18种α亚基与8种β亚基,共形成了24种不同的异源二聚体。大量的研究证实整合素家族在椎间盘退变中发挥重要作用。整合素α5β1是髓核细胞基质降解的关键受体。整合β1亚基的过度表达可减少髓核细胞凋亡进而抑制椎间盘退变。细胞外基质中的纤连蛋白通过调节整合素β1/FAK通路维持髓核细胞的功能。结缔组织生长因子CCN2也被证实通过整合素α5β1和αVβ3抑制白细胞介素-1β诱导的髓核细胞分解代谢增强。在前期预实验中,给予髓核细胞高氧张力刺激后,我们筛选出了受高氧张力影响最大的整合素亚基—整合素α6。本研究拟对高氧张力上调整合素α6的表达机制,整合素α6在退变椎间盘组织的表达水平以及整合素α6调控髓核细胞代谢的可能机制及体内研究进行深入探讨。【研究目的】1、探讨高氧张力通过激活PI3K/AKT信号通路上调整合素α6的表达;2、探讨整合素α6在退变椎间盘组织的表达水平;3、整合素α6调控髓核细胞代谢的可能机制及其体内研究。【研究方法】第一部分1、获得实验用髓核细胞。使用3月龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠尾椎间盘分离、提取、培养和传代髓核细胞,使用P2或P3代细胞进行实验;2、明确高氧张力影响最显著的整合素亚基基因。髓核细胞高氧张力暴露刺激24h后,使用实时荧光定量聚合酶链反应（real time reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测12个已知的整合素亚基,筛选出变化最为明显的整合素亚基;3、明确高氧张力在蛋白层面上调整合素α6表达。髓核细胞暴露于高氧张力不同时间,通过Western blot和免疫荧光检测整合素α6的表达;4、明确整合素α6对髓核细胞退变的影响。通过小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默整合素α6,通过Western blot检测髓核细胞退变表型;5、明确高氧张力通过PI3K/AKT通路上调整合素α6表达。激活或抑制PI3K/AKT通路,通过Western blot检测整合素α6的表达情况。第二部分1、明确不同退变等级的人髓核组织中整合素α6表达水平。根据Pfirrmann分级标准收集临床不同退变等级的椎间盘髓核组织样本,通过组织学检查确认退变程度,然后通过Western blot和免疫荧光检测整合素α6表达情况;2、明确不同退变等级的大鼠髓核组织中整合素α6的表达水平,以及低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α）的表达和细胞凋亡情况。通过大鼠尾椎针刺法构建IVDD模型,组织学检查确认造模成功,通过Western blot和/或免疫荧光检测整合素α6和HIF-1α的表达,TUNEL染色检测细胞凋亡。第三部分1、明确高氧张力和整合素α6对髓核细胞凋亡的影响。使用siRNA沉默整合素α6后,去血清培养髓核细胞构建细胞凋亡模型,根据分组分别于低氧和高氧张力下培养24h,通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞分析细胞凋亡比例、Western blot检测凋亡相关蛋白表达,线粒体膜电位和凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor,AIF）变化的检测,明确高氧张力和整合素α6对凋亡的调控作用;2、明确高氧张力和整合素α6对髓核细胞氧化应激的影响。使用siRNA沉默整合素α6,根据分组给予低氧和高氧张力刺激24h,通过流式细胞分析和荧光显微镜检测活性氧（reactive oxygen species,ROS）的表达情况;3、明确HIF-1α和整合素α6之间的调控作用。通过沉默或过表达HIF-1α,检测整合素α6的表达情况,沉默整合素α6后检测HIF-1α的表达情况,明确二者的关系;4、明确体内局部沉默整合素α6对椎间盘退变的影响。构建壳聚糖（chitosan）包裹整合素α6或NC（negative control）的siRNA形成纳米颗粒溶液（siRNA-ITGα6/NC-CH）,构建大鼠尾椎IVDD模型时局部注射siRNA-ITGα6-CH,以达到体内转染沉默整合素α6的目的,通过Western blot检测沉默效果,核磁共振（magnetic resonance imaging,MRI）、组织学检查和免疫荧光检测椎间盘退变情况。【研究结果】1、高氧张力在髓核细胞中通过激活PI3K/AKT信号通路上调整合素α6的表达;2、激活PI3K/AKT/ITGα6通路可保护髓核细胞抵抗高氧张力导致的细胞外基质蛋白合成减少;3、轻度退变的人体和大鼠髓核组织中整合素α6表达增加;4、整合素α6保护髓核细胞免受高氧张力诱导的凋亡;5、整合素α6可防止髓核细胞中高氧张力诱导的ROS产生;6、髓核细胞中HIF-1α和整合素α6之间存在相互作用和反馈调节;7、体内局部沉默整合素α6可加速大鼠尾椎针刺诱导的椎间盘退变。【研究结论】1、整合素α6在椎间盘退变早期表达增加;2、髓核组织低氧环境的破坏是整合素α6表达增加的主要原因;3、整合素α6可以保护髓核细胞免受高氧张力诱导的凋亡、氧化应激增加以及细胞外基质蛋白合成减少;4、体内沉默整合素α6可明显加速针刺诱导的椎间盘退变。