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烟草青枯病是由茄劳尔氏菌[Ralstonia solanacearum(E.F.Smith)]引起的一种细菌性病害,在国内的广东、福建等南方地区普遍发生。近几年来,该病的发生和危害范围有向北方烟区扩展的趋势,在山东、河南及陕西等省均有发生,局部地区为害较重,已成为烟草主要病害之一。
本实验室从来源于山东临沂的烟田土样中筛选出一株放线菌菌株Y23,该菌株对烟草青枯病菌等多种植物病原菌有明显的抑制作用。本实验主要从菌株Y23发酵抑菌活性物质的稳定性、理化性质、分离提纯方法等几个方面进行研究:
1.分别采用抑制菌丝生长速率法和琼脂扩散法测定了Y23菌株发酵液对15种病原真菌、3种病原细菌的抑菌活性。结果表明,Y23菌株发酵液对禾谷镰刀菌、苹果轮纹病菌、大麦条纹病菌的菌丝生长抑制率达55%以上,占供试真菌数的20%;琼脂扩散法生测结果表明,Y23菌株发酵液只对烟草青枯病菌有抑制作用。发酵液的稳定性测定结果表明,发酵液低温贮藏效果好,对热、酸碱及紫外光照稳定性较强,对日光照稳定性较差。
2.发酵液通过有机溶剂萃取实验,选择乙酸乙酯为适宜的萃取剂。经预处理、溶媒萃取等步骤后,采用硅胶柱色谱对活性物质进行分离。首先以硅胶薄层色谱初步筛选分离条件,在此基础上,进一步优化柱色谱条件:依次采用石油醚:异丙醇为9:1、7:3、5:5、2:8洗脱,结果取得了较好的分离效果。最后采用硅胶薄板层析法,以石油醚:异丙醇:甲醇为10:1:0.5做展开剂薄层层析时,分离得到了1种对烟草青枯病菌有明显抑菌作用的活性物质。
3.利用高效液相色谱对分离产品进行纯度分析,为得到最佳的效果,试验对色谱条件进行优化,结果为:色谱柱EclipseXDB_C18,5μm,4.6㎜×150㎜;以甲醇-水系统60:40为流动相;流动相流速为1mL/min;柱温30℃;紫外检测波长207nm。结果表明,分离提取的活性物质纯度较高,可以满足光谱分析等进一步研究的需要。
4.拮抗产物纯品的理化性质和官能团反应。通过捷克八溶剂系统纸色谱和pH纸色谱检测,表明该活性物质是一类极性、酸性和水溶性较强的抗生素。通过官能团反应,结合紫外光谱分析,初步推断该拮抗产物纯品为一种多糖。