【摘 要】
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目的:探究t RF-Ile-AAT-1调控IRF4的表达情况以及其对TURBT术后膀胱残癌细胞增殖和侵袭的影响。方法:建立高度恶性膀胱癌细胞株T24和低度恶性膀胱癌细胞株5637热损伤细胞模型,采用CCK-8及BALB/C裸鼠皮下植瘤比较热损伤前后细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡、Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化。Small RNA-Seq检测T24和5637热损伤前后差异表达t
【基金项目】
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国家自然科学基金-青年项目:tRFGln通过调控CEBPa/MAGL轴抑制HIFU消融后残余HCC细胞增殖和侵袭项目编号:NO.8180111628；
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目的:探究t RF-Ile-AAT-1调控IRF4的表达情况以及其对TURBT术后膀胱残癌细胞增殖和侵袭的影响。方法:建立高度恶性膀胱癌细胞株T24和低度恶性膀胱癌细胞株5637热损伤细胞模型,采用CCK-8及BALB/C裸鼠皮下植瘤比较热损伤前后细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡、Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化。Small RNA-Seq检测T24和5637热损伤前后差异表达tRFs,将筛选出目的tRFs进行回返性细胞株以及临床标本RT-PCR验证。运用mi Randa和Target Scan数据库预测目的t RF的靶基因。采用Western blotting检测靶基因在T24和5637热损伤前后蛋白水平表达变化,采用免疫组化比较临床正常膀胱上皮、膀胱癌旁组织、第一次TURBT所取膀胱癌组织、第二次TURBT所取膀胱癌组织中靶基因表达差异。构建目的t RF的单链模拟物（mimic）和反义链（inhibitor）,转染入热损伤后的T24及5637细胞,分别通过CCK-8、流式细胞术、Transwell实验研究目的t RF对热损伤后膀胱残癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的调控作用,并运用Western blotting检测转染后T24及5637表达靶基因水平。结果:通过对热损伤前后T24和5637进行CCK-8、流式细胞术、Transwell实验分析,显示热损伤后的T24和5637增殖能力较前降低、凋亡能力较前增高,迁移和侵袭能力较前降低,但唯有5637实验结果具有统计学意义,而BALB/C裸鼠皮下植瘤实验于植瘤后4周观察到所取瘤体标本中T24热损伤组较对照组体积明显增大,而5637热损伤组较对照组体积显著减小。通过small RNA-Seq检测到于T24热损伤后较热损伤前表达降低且于5637热损伤后较热损伤前表达增高的tRFs共计15个,排列前5位的tRFs分别为:t RF-Asn-GTT-1,t RF-chr M.Thr-TGT,t RF-chr M.Ser-GCT,t RF-Glu-TTC-2,t RF-Ile-AAT-1,RT-PCR验证上述5个tRFs在T24和5637热损伤前后mi RNA表达水平,结果证实了t RF-chr M.Ser-GCT和t RF-Ile-AAT-1如预期筛选条件,但唯有t RF-Ile-AAT-1在低级别膀胱癌患者第二次TURBT术后膀胱癌标本中的表达高于第一次TURBT,且在高级别膀胱癌患者的表达又低于第一次TURBT。进一步运用mi Randa和Target Scan数据库预测到t RF-Ile-AAT-1的靶基因共计263个,对靶基因进行“Structure评分”、“Free energy评分”、“Context+评分”综合分析后,最终定位的靶基因为IRF4。通过Western blotting对T24和5637热损伤前后IRF4蛋白水平表达检测,结果显示IRF4在T24热损伤组较对照组表达升高,而在5637热损伤组较对照组表达降低。免疫组化显示临床中高级别膀胱癌患者第二次TURBT所取癌组织较第一次TURBT所取癌组织IRF4表达水平显著增高。转染mimic和inhibitor后,CCK-8结果显示t RF-Ile-AAT-1 mimic可以明显抑制膀胱癌细胞的增殖,流式检测显示t RF-Ile-AAT-1 mimic显著增加了膀胱癌细胞的凋亡率,Transwell实验提示t RF-Ile-AAT-1 mimic可降低膀胱癌细胞迁移和侵袭能力,Western blotting结果表明t RF-Ile-AAT-1 mimic可使IRF4蛋白表达显著降低,而在转染t RF-Ile-AAT-1 inhibitor中观察到了上述相反的结果。结论:本研究结果表明,低度恶性膀胱癌细胞热损伤后产生大量的t RF-Ile-AAT-1可通过沉默IRF4的表达,抑制TURBT术后膀胱残癌细胞的增殖和侵袭能力。
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