在自然界中,植食性昆虫以植物为食,是世界作物的主要胁迫因子,常常导致粮食的减产。水稻（Oryza sativa L.）是世界三大粮食作物之一,而褐飞虱（Nilaparvata lugens St（?）l.,BPH）是亚洲稻区危害最严重的害虫之一（Schultz,2002;Hogenhout and Zipfel,2015;Khush,2005）。近几十年,农民主要依靠农药来对褐飞虱进行防治,尽管在短期内取得了成效,但也导致稻飞虱产生了抗药性。目前,种植含有抗稻飞虱基因的水稻品种是公认的控制褐飞虱最经济、最环保的方法。尽管目前已有多个抗飞虱基因被克隆,它们产生抗性的机制却并不清楚。研究植物-昆虫互作机理,将为农业生产中害虫可持续控制提供重要支撑。本实验室在前期工作中克隆了一个定位于水稻第四染色体的抗褐飞虱基因Bph6。Bph6基因编码一个981氨基酸的蛋白质。BPH6蛋白定位于胞泌复合体中,能够促进胞泌复合体亚基Os EXO70E1和细胞壁蛋白Os SAMS2向细胞外的分泌。同时,细胞分裂素（Cytokinin,CK）能够通过调控萜烯类植保素的产生来调控水稻对褐飞虱的抗性。在这些研究基础之上,我们采用了酵母双杂交筛选水稻文库和串联亲和纯化及质谱技术来筛选BPH6的互作蛋白。我们得到了与BPH6互作的蛋白NDU,对NDU蛋白的结构分析发现NDU蛋白全长274个氨基酸,在125-233氨基酸区间形成βαβαββα结构,具有一个Thioredoxin-like（硫氧还蛋白酶）结构域。二硫键还原酶活性测试结果表明,NDU-HIS融合蛋白具有二硫键还原酶活性。在近等基因系中的抑制NDU基因的表达使植株对褐飞虱抗性减弱,这说明NDU基因在Bph6介导的抗性通路中起重要的作用。水稻原生质体亚细胞定位的结果显示NDU单独转化时定位于线粒体,与BPH6共转则共定位于细胞质。我们分别分离了日本晴和Bph6植株的线粒体和细胞质成分,用免疫印迹的方法检测了NDU的表达。实验结果表明,NDU在日本晴中定位于线粒体,而在Bph6植株中定位于线粒体和细胞质。这说明BPH6能够通过互作将NDU释放到细胞质中。我们找到了NDU在细胞质中的互作蛋白NH5,并且在Bph6植株中对NH5基因进行了敲除。nh5突变体植株均出现种皮开裂的表型,说明NH5可以调控水稻种子的发育。由于T0代结的种子非常少,nh5突变体在抗虫方面的表型需要等到T1代收种后再进行验证。NH5属于水稻NPR1-like基因家族,目前没有文献报道NH5基因参与水稻的抗性,NH1则通过对PR基因的调控参与调控水稻对稻瘟病和白叶枯的抗性。基因表达分析发现在含有Bph6的材料中PR1b、PR5和PR10的表达量比不含Bph6的材料显著提高。这暗示着NH基因有可能参与Bph6的抗性通路。我们接下来研究了BPH6与NH蛋白之间的互作关系,发现它能够与NH3互作。利用CRISPR/Cas9的方法在Bph6植株中敲除NH3,所有的植株叶片均出现棕色的坏死小斑,同时nh3突变体植株对褐飞虱的抗性增强,这说明NH3在抗褐飞虱反应中可能起到负调控的作用。我们继续研究了NH3调控水稻抗褐飞虱的分子机制,发现NH3能够在酵母和原生质体中与NH1发生互作,同时NH3能够在水稻原生质体中促进NH1的降解。亚细胞定位表明NH3一部分定位于细胞中的膜系统,一部分在细胞质中聚集成团,与BPH6共转原生质体则共定位于细胞质,说明BPH6对NH3的定位产生了影响。我们也发现BPH6能在原生质体中使NH3的蛋白量减少,结合二者的共定位结果,很可能BPH6通过促进蛋白运输的功能来调控NH3的蛋白量。对BPH6互作蛋白的研究有助于拓宽了Bph6的抗虫分子机理研究,并为作物-害虫相互作用机理研究提供新的理论基础。