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小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)已在发育生物学、人类疾病和药物开发等研究领域中得到广泛应用,小鼠ESCs建系技术的丰富完善为建立人类和动物ESCs系提供了参照标准和理论依据。目前小鼠ESCs建系主要来自129小鼠,少部分来自C57BL/6J和BALB/c小鼠,除129及杂交小鼠ESCs建系比较容易外,其他品系小鼠ESCs建系比较困难,建系效率很低。昆明(KM)小鼠是国内广泛使用的实验动物,但其ESCs分离建系很困难,大多数情况下只能在体外传几代,却不能充分增殖。所以,仍需要继续研究昆明小鼠ESCs。本研究在优化小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast, MEF)饲养层制备条件的基础上,比较不同添加物对昆明小鼠ESCs分离培养的影响;以129♂×KM♀杂交F1代小鼠胚胎为材料,分离培养小鼠ESCs,建立了该杂交小鼠ESCs的分离培养体系,获得了1株传52代的类ESCs,1株传38代的孤雌胚胎来源的类ESCs(pESCs),为更深入研究奠定了基础并准备了材料。本研究获得如下结果:1.MEF饲养层制备条件的优化利用MTT法检测丝裂霉素C(10ug/mL)处理后MEF活力变化情况,比较不同条件下MEF活力稳定维持的时间。结果显示,以5代以内MEF制备饲养层,用丝裂霉素C(10ug/mL)处理2~3h,以1.2~1.6×104/孔的细胞量接种96孔板,用体积分数10%犊牛血清(Neonatal bovine serum, NBS)的培养液培养,MEF活力可稳定维持10~12 d,是制备MEF饲养层的适宜条件。2.昆明小鼠ESCs分离培养影响因素的研究以昆明小鼠胚胎为材料,以丝裂霉素C(10ug/mL)处理的MEF为饲养层,共培养493枚胚胎,获得287个ICM集落(58.2%),将2株ESCs传到7代(0.697%),细胞表现碱性磷酸酶活性,表达Oct-4和Nanog蛋白。①ESCs培养液中添加KSR,胚胎平均贴壁时间为4.58±1.05 d,比添加FBS的平均贴壁时间(3.74±1.10 d)显著延长(P<0.05),胚胎贴壁率显著低于添加FBS(P<0.05),ICM集落形成率二者没有显著差异(P>0.05);1~5代ESCs传代结果显示,KSR比FBS显著有利于维持昆明小鼠ESCs的未分化状态。②在ESCs培养液中添加FBS+ PD98059(50μmol/L),胚胎平均贴壁时间为5.56±1.15 d,胚胎贴壁率、ICM集落形成率显著低于添加KSR或FBS(P<0.05),不能有效维持昆明小鼠ESCs的未分化状态。③昆明小鼠胚胎ICM和ESCs适宜用0.05%胰酶-0.02%EDTA离散消化,并配合机械分割。3.杂交小鼠ESCs的分离与鉴定①以129♂×KM♀杂交F1代小鼠胚胎为材料,以丝裂霉素C(10ug/mL)处理的MEF为饲养层,培养杂交小鼠胚胎135枚,形成ICM集落72个(53.3%),获得7株传9代以上的细胞,其中3株分别传了52代(编号为060728084)、40代(编号为070109137)和11代(070109153),这3株细胞有细胞冻存。对其中编号为060728084的细胞株进行鉴定。结果显示,该细胞株在33代以内75%以上细胞保持核型完整,核型为XY;具有小鼠ESCs特征性的酶活性(AKP和端粒酶)、标志抗原(SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、Oct-4和Nanog)和基因(Oct-4、Nanog和GDF-3)的表达模式,体内外能分化为三胚层来源的各种类型细胞(免疫组化检测7种标志抗原,RT-PCR检测5个标志基因),除未进行嵌合体鼠实验外,其余均符合小鼠ESCs建系的各项要求。②添加3.75%FBS+ 11.25%KSR、7.5%FBS+ 7.5%KSR和15%FBS的3组培养液,其胚胎贴壁率显著高于添加15%KSR的培养液(P<0.05);添加3.75%FBS+ 11.25%KSR和7.5%FBS+ 7.5%KSR的培养液,更有利于ICM集落形成。③1~5代ESCs传代结果显示,添加15%KSR、1%FBS+ 14%KSR和3.75%FBS+11.25%KSR均能支持ESCs未分化生长;单细胞接种实验显示,添加1%FBS+14%KSR、3.75%FBS+11.25%KSR和7.5%FBS+ 7.5%KSR,其克隆形成率显著高于添加15%KSR和15%FBS。4.杂交小鼠孤雌胚胎来源ESCs的分离与鉴定①以129♂×KM♀杂交F1代小鼠MⅡ期卵母细胞为材料,经过孤雌激活、体外培养获得35枚孤雌囊胚,在MEF饲养层上培养30枚胚胎,形成11个ICM集落(36.7%),离散后接种其中8个,最终获得1株能稳定传代的pESCs,命名为P061221132,目前传到38代,有细胞冻存。对细胞株P061221132进行鉴定。结果显示,该细胞株在23代内70%以上细胞保持核型完整,核型为XX,具有小鼠ESCs特征性的酶活性(AKP和端粒酶)、标志抗原(SSEA-1、SSEA-3、Oct-4和Nanog)和基因(Oct-4、Nanog和GDF-3)的表达模式,体内外能分化为三胚层来源的各种类型细胞(免疫组化检测5种标志抗原,RT-PCR检测5个标志基因),除未进行嵌合体鼠实验外,其余均符合小鼠ESCs建系的各项要求。②单细胞接种实验显示,在ESCs培养液中分别添加1%FBS+14%KSR、3.75%FBS+11.25%KSR和7.5%KSR+7.5%FBS,克隆形成率为41.7%~45.4%之间,不同代次细胞在不同培养液中的克隆形成率之间没有显著差异(P>0.05),但添加7.5%KSR+ 7.5%FBS,ESCs集落形态不如添加1%FBS+14%KSR、3.75%FBS+ 11.25%KSR典型。