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第一部分:葡萄糖酸氯己定诱导的小鼠房颤模型的建立目的:1)在小鼠中用葡萄糖酸氯己定诱导心房颤动的发作;2)检测模型小鼠心房组织重构变化。方法:C57/B6小鼠随机分组,每组6只,运用小动物呼吸机辅助机械通气并给予异氟烷麻醉小鼠,开胸后在小鼠心房表面均匀涂抹不同剂量无菌性葡萄糖酸氯己定(0.05μL/g小鼠体重,0.1μL/g,0.2μL/g,0.3μL/g,0.4μL/g,0.5μL/g,0.6μL/g),并在手术后的不同时间点(1d,2d,3d,4d,5d,7d,14d),运用体表心电图及食道心房调搏技术,监测小鼠体表及食道心房心电图,通过食道刺激电极给予心房不同频率的阵发连续快刺激(10Hz,20 Hz,30 Hz,40 Hz,50 Hz,60 Hz,70 Hz)诱发房颤,记录小鼠房颤诱发率和房颤持续时间,并比较各组之间有无差异。AF被规定为具有不规则心室节律的快速且破碎的心房心电图至少1秒。通过计算房颤发作次数除以总的刺激次数来确定房颤的诱导率(AFR)。AF发作的总时间被定义为AF持续时间(AFD)。同时,采集各组小鼠心房组织做冰冻切片,进行HE染色,Masson染色,α-SMA染色和CD68染色,观察各组小鼠心房组织的炎症和纤维化的程度及进展。采集各组小鼠心房组织并提取RNA进行逆转录,通过RT-PCR检测各组小鼠心房组织中炎症相关因子(IL-6,IL-10,TNF-α)以及纤维化相关因子(TGF-β,α-SMA,collagen-1,collagen-3,collagen-4)mRNA表达水平。同时,提取各组小鼠心房组织蛋白,通过Western Blot的方法检测STAT3磷酸化水平。结果:小鼠在涂抹葡萄糖酸氯己定后房颤的诱发率升高且房颤持续时间延长,并呈现对葡萄糖酸氯己定的剂量依赖型,二者均在0.4μL/g剂量以下时快速增加,0.4μL/g以后呈现缓慢上升趋势。小鼠的存活率结果显示随着葡萄糖酸氯己定剂量增加小鼠的存活率逐渐降低,在0.4μL/g剂量时存活率为50%,而0.4μL/g以上后迅速降低。综上两个结果,葡萄糖酸氯己定的剂量取0.4μL/g最为合适。另外,不同频率对小鼠食道心房的刺激结果显示在40Hz、50Hz、60Hz刺激时显示较高的房颤诱发率和较长的房颤持续时间。0.4μL/g葡萄糖酸氯己定涂抹手术后第1d,2d,3d,4d,5d,7d,14d时分别对小鼠进行40Hz&50Hz&60Hz食道心房刺激,即40Hz,50Hz和60Hz各10秒的连续性快速刺激,共3次,每次间隔5分钟。结果显示小鼠房颤的诱导率以及房颤的持续时间均在术后第4天达到高峰。HE染色显示心房组织炎症细胞浸润从术后第2天开始逐渐加重,在第4天达到峰值;Masson染色显示心房组织胶原沉积从术后第4天开始逐渐加重,在第14天达到峰值;α-SMA染色显示心房组织α-SMA从术后第3天开始逐渐加重,在第14天达到峰值;CD68染色结果显示心房组织巨噬细胞浸润从术后第2天开始升高,第3天达到峰值,到术后第5天降到正常水平。RT-PCR结果显示了术后第1d,2d,3d,4d,5d,7d,14d心房组织中炎症相关因子(IL-6,IL-10,TNF-α)以及纤维化相关因子(TGF-β,α-SMA,collagen-1,collagen-3,collagen-4)mRNA表达水平的变化。Western Blot结果显示术后心房组织STAT3磷酸化水平呈逐渐降低趋势。结论:对小鼠心房涂抹葡萄糖酸氯己定可成功诱导小鼠房颤发作,手术小鼠心房组织呈现明显的心房重构,具体表现为心房组织炎症细胞的浸润以及胶原纤维和α-SMA沉积;此模型的成功建立为以后的研究奠定了实验基础和理论基础;葡萄糖酸氯己定可能参与临床开胸术后房颤患者的发病及病理进程,减少葡萄糖酸氯己定对开胸手术患者心房的接触有望成为临床预防开胸术后房颤的新靶点。第二部分:心肌注射骨髓来源间充质干细胞抑制葡萄糖酸氯己定诱导的小鼠房颤的发作目的:心房纤颤的发生与心房的炎症和纤维化密不可分,心肌注射BMSC能否改善心房炎症和纤维化,能否抑制房颤的发作,迄今尚无这方面的研究报道。本实验旨在葡萄糖酸氯己定诱导的小鼠房颤模型的基础上,探讨BMSC在房颤中的作用及其潜在的分子机制。方法:C57/B6小鼠随机分为4组,每组6只:sham组(只做开胸处理);CG组(给予0.4μL/g葡萄糖酸氯己定心房涂抹);vehicle组(0.4μL/g葡萄糖酸氯己定心房涂抹+PBS心肌注射);BMSC组(0.4μL/g葡萄糖酸氯己定心房涂抹+BMSC心肌注射)。手术后第4天运用体表心电图和食道心房调搏技术诱导房颤发作,检测各组小鼠房颤诱发率和房颤持续时间。然后将小鼠处死,留取左右心房组织。HE染色检测各组小鼠心房组织炎症细胞浸润情况,Masson染色检测各组小鼠心房组织胶原含量,α-SMA染色检测心房α-SMA表达变化,CD68染色检测心房组织巨噬细胞浸润情况。ELISA检测各组小鼠心房组织IL-6和IL-10水平。RT-PCR方法检测各组小鼠心房组织炎症相关因子IL-6、IL-10、TNF-α以及纤维化相关指标TGF-β、collagen-1、collagen-3,collagen-4、α-SMA的mRNA表达变化。Western Blot检测心房组织STAT3磷酸化情况。结果:与vehicle组小鼠相比,小鼠在注射BMSC后房颤的诱发率降低且房颤持续时间明显缩短。Real Time PCR结果显示,BMSC组小鼠心房组织炎症相关因子IL-6mRNA显著低于vehicle组,而抗炎因子IL-10 mRNA显著高于vehicle组,纤维化相关指标TGF-β、collagen-1、collagen-3,α-SMA的mRNA表达水平显著低于vehicle组。HE染色、Masson染色与α-SMA染色结果显示,BMSC组小鼠心房组织炎症细胞浸润明显少于vehicle组,且胶原含量和α-SMA含量显著低于vehicle组;CD68染色结果显示,BMSC组小鼠心房组织巨噬细胞浸润明显高于vehicle组。ELISA结果显示BMSC组小鼠心房组织IL-6低于vehicle组,而IL-10水平明显高于vehicle组。Western Blot结果显示BMSC组小鼠心房组织STAT3磷酸化程度明显高于vehicle组。结论:小鼠心肌注射BMSC可显著抑制房颤,表现为降低的房颤诱发率和缩短的房颤持续时间。BMSC注射可有效抑制心房组织炎症和纤维化。BMSC有望成为临床治疗术后房颤的新型替代疗法。第三部分:体外培养的骨髓来源间充质干细胞通过STAT3磷酸化诱导RAW264.7细胞分泌IL-10目的:心肌注射BMSC可明显促进心房组织巨噬细胞浸润,升高小鼠心房组织中的IL-10水平,本部分实验拟通过体外模拟小鼠CG刺激的模型,研究升高的IL-10来源,以及BMSC在体外促进IL-10的作用及其潜在的可能机制。方法:分离并培养小鼠BMSC,将第四代BMSC与RAW264.7小鼠巨噬细胞系共培养。我们将这两种细胞群直接接触混合培养,或者将它们放置在一个transwell系统中,在这个系统中两个细胞群由一个可渗透膜相互分开,运用ELISA方法检测上清IL-10水平。为了确定哪些细胞群体导致了IL-10水平变化,我们将BMSCs和RAW264.7共培养,然后在24小时后通过磁珠分选技术将它们分为CD11b-细胞群和CD11b+细胞群,并运用RT-PCR和Western Blot检测上述两种细胞群中IL-10 mRNA表达水平和STAT3磷酸化水平。并运用STAT3磷酸化抑制剂探讨STAT3与IL-10分泌的关系。结果:当巨噬细胞与BMSCs直接接触时,共同培养基中IL-10的水平显着高于transwell培养水平。RT-PCR结果显示BMSCs几乎不表达IL10 mRNA,然而巨噬细胞表达IL10mRNA,并且与BMSCs共培养后该表达水平显著上调。当巨噬细胞与BMSC共培养后其STAT3磷酸化水平增加,而运用STAT3抑制剂后IL-10表达被显著抑制。结论:BMSC可以通过与巨噬细胞直接接触促进IL-10分泌,此过程可能与STAT3磷酸化有关,升高的IL-10来源于巨噬细胞群而非BMSC本身。