论文部分内容阅读
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起，主要通过血源传播的一种世界性传染病。流行病学资料表明，HCV感染呈全球性分布，在西方国家的普遍人群感染率为1％，我国高达3.2％。目前全世界至少有1亿人携带HCV，每年约有1百万新的HCV感染者。HCV感染后，约有50-80％的感染者发展为慢性肝炎，在此基础上约25％的患者最终演变为肝硬化，并与肝细胞癌（HCC）的发生密切相关。HCV基因组变异率高，病毒准种多，目前尚无有效的抗病毒治疗药物。 核酶（Rz）是一类具有酶活性的RNA分子，可序列特异性地结合并切割靶RNA，从而阻断靶基因的复制和表达。锤头结构Rz分子较小、结构简单、易于设计合成，作为新的抗病毒治疗手段，已在多种病毒的基因治疗研究中显示出潜在的应用价值。本研究选择高度保守的5’NCR和C区为靶序列，在体外设计合成两个锤头结构Rz，研究Rz在体外对靶RNA的切割作用和在细胞内对HCV基因表达的抑制作用。同时探讨建立带荧光素酶（luc）报告基因的四环素调控性细胞模型的方法。 主要研究内容如下： 1 根据锤头结构Rz的设计原理，以HCV-H株基因序列为靶，通过对靶RNA二级结构的能量分析，在HCV 5’NCR和C区选择出213、260、470和478四个理想的靶位点，设计出Rz的基因序列。为了解这4个Rz的“广谱性”，分析比较了具有代表性的5株HCV序列，其Rz切点两翼碱基（7-8nt）的同源性为100％。 2 选择针对5’NCR的213和260两位点，在体外合成Rz213和Rz260单链基因，通过亚克隆技术将Rz基因插入两端带有自剪切Rz的pGENE8459v3载体，然后重组在pcDNA3真核表达载体的CMV启动子下游。酶切鉴定结果表明，我们所构建的体外转录载体（pGEM-Rz）、自剪切亚克隆载体（pGENE-Rz）和真核表达载体（pcEM-Rz和pcENE-Rz）的连接正确。为了保证Rz序列的正确性，对pGEM-Rz213进行了手工测序，结果与设计合成的Rz序列完全一致。 3 应用α-32P-UTP在体外标记靶RNA，通过放射性自显影方法检测体外转录Rz对靶RNA的切割作用，结果表明Rz213和Rz260均可位点特异性切割靶RNA。 4 通过脂质体（lipofectamine）介导的细胞转染，将Rz基因真核表达载体导入体外