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背景与目的microRNA（miRNA）是近年来发现的一种单链非编码RNA,其长度约20-25个核苷酸序列。miRNA通过与目标基因的m RNA结合使其降解或失活,从而达到对基因进行负向调控的目的。miRNA的基因调控作用广泛存在于细胞增殖、分化以及死亡等诸多生物学过程。已有研究表明,miRNA与肿瘤的发生、发展、耐药性等密切相关,其中,miRNA-21（miR-21）被认为是一种重要的肿瘤促进因子,普遍存在于神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、乳腺癌等肿瘤中,可作为潜在靶点用于肿瘤的早期诊断和治疗。为深入了解miRNA的生物学功能,有必要利用非侵入性成像技术对miRNA进行活体监测。近年来,基于报告基因的光学成像已被用于miRNA的可视化研究,但光学成像具有组织穿透性差以及发光物质容易猝灭等缺点,在很大程度上降低了其临床应用潜能。磁共振成像（MRI）具有无辐射、不受组织厚度限制、软组织分辨率高等优点,较其它成像手段更易于临床转化。随着报告基因成像技术的不断进展,MRI在分子影像学领域的应用越来越广。目前用于MR成像研究的报告基因有多种,其中以铁蛋白（FTH1）基因的应用最为成熟和广泛。在前期研究中,我们利用FTH1标记了肿瘤细胞或间充质干细胞,这些细胞在体外或体内均可有效聚铁,并引起明显的MRI信号变化。本研究将miR-21对基因的调控作用用于MRI报告基因成像,通过基因改造构建miR-21反应性的FTH1基因报告系统,将该基因报告系统转入人神经母细胞瘤细胞（SK-N-SH）中,并利用miR-21的反义寡核苷酸antagomiR-21对细胞内miR-21进行干预,同时行MR成像观察细胞的信号变化,探讨利用报告基因MRI体内、外显示SK-N-SH细胞中miR-21动态变化的可行性。方法1 miR-21反应性FTH1报告基因的构建及鉴定应用PCR扩增FTH1基因,并将其插入慢病毒载体质粒p LVX-m CMV-Zs Green1-Puro的多克隆位点内,得到FTH1过表达慢病毒载体p LVX-m CMV-Zs Green1-Puro-FTH1（p LVX-FTH1）,通过DNA测序及酶切验证鉴定其是否构建成功。接着将与miR-21基因完全互补的三段靶序列（3×C＿miR-21）通过基因工程技术将连接在FTH1过表达慢病毒载体末端,得到FTH1-3×C＿miR-21过表达慢病毒载体p LVX-m CMV-Zs Green1-Puro-FTH1-3×C＿miR-21（p LVX-FTH1-3×C＿miR-21）,并行测序鉴定。将两种报告基因的慢病毒载体质粒分别进行包装纯化并用超滤法浓缩,采用稀释滴度测定法进行慢病毒滴度测定。2 FTH1-3×C＿miR-21基因报告系统在SK-N-SH细胞内的表达及调控分别利用LVX-FTH1和LVX-FTH1-3×C＿miR-21两种慢病毒感染SK-N-SH细胞。感染后的细胞经过Puromycin筛选3代,最终得到稳转株SK-N-SH/FTH1和SK-N-SH/FTH1-3×C＿miR-21。将未转染慢病毒的SK-N-SH/WT为空白对照组,SK-N-SH/FTH1作为对照组,SK-N-SH/FTH1-3×C＿miR-21作为实验组。通过qPCR和免疫印迹法初步鉴定FTH1在SK-N-SH/WT、SK-N-SH/FTH1、SK-N-SH/FTH1-3×C＿miR-21这3组细胞中的表达情况,同时应用CCK-8试剂检测细胞活力。然后将不同浓度的anagomiR-21导入细胞,Western blot（WB）及MRI检测antagomiR-21浓度与FTH1表达的量-效关系。最后以最适antagomiR-21浓度转染3组细胞,并行MR成像、普鲁士蓝染色和电镜检测。3基于miR-21反应性报告基因的MRI活体检测SK-N-SH细胞移植物内miR-21的动态变化将SK-N-SH/WT、SK-N-SH/FTH1和SK-N-SH/FTH1-3×C＿miR-21分别种植在裸鼠右后肢根部皮下,建立神经母细胞瘤模型。按30 nmol/g剂量经尾静脉注射antagomiR-21,在注射前及注射后24 h分别行7.0TMR成像,并测定R2值。MR扫描完成后,取瘤组织行普鲁士蓝染色。结果1 miR-21反应性FTH1基因报告系统的构建及鉴定PCR产物酶切及DNA测序表明了质粒p LVX-FTH1和p LVX-FTH1-3×C＿miR-21的成功构建,并且获得的病毒滴度分别为1.5×10~8TU/m L和1.2×10~8 TU/m L,符合实验要求。2 FTH1-3×C＿miR-21基因报告系统在SK-N-SH细胞内的表达及调控qPCR结果显示在转染antagomiR-21前,3组细胞中SK-N-SH/FTH1和SK-N-SH/FTH1-3×C＿miR-21组可以检测到明显的FTH1表达,而SK-N-SH/WT组无明显表达;WB显示在转染antagomiR-21前,3组细胞中只有SK-N-SH/FTH1组细胞可以检测到明显的FTH1表达,其余两组细胞无明显表达;CCK-8实验结果表明,3组细胞的细胞活性无明显差异,说明基因转导不会影响细胞的正常生长;不同浓度antagonmiR-21转染SK-N-SH/FTH1-3×C＿miR-21组细胞后,FTH1表达及相应的MRI信号改变存在剂量依赖性,且在antagonmiR-21浓度为40 nmol/L时FTH1表达量最高;以最佳antagomiR-21浓度分别转染3组细胞后,SK-N-SH/FTH1-3×C＿miR-21组较转染前有明显的MRI信号降低,其它两组转染前后均无明显信号改变,细胞内铁检测结果与MRI结果基本一致。3基于miR-21反应性报告基因的MRI活体检测SK-N-SH细胞移植物内miR-21的动态变化成功构建了SK-N-SH细胞移植瘤裸鼠模型。在使用antagomiR-21干预前,与SK-N-SH/WT组比较,SK-N-SH/FTH1组信号减低,而SK-N-SH/FTH1-3×C＿miR-21组信号改变不明显。antagomiR-21干预后,SK-N-SH/FTH1-3×C＿miR-21组较干预前有明显的MRI信号降低,其余2组干预前和干预后MRI信号变化均不明显;肿瘤组织铁检测和MRI结果基本一致。结论成功构建了miR-21反应性FTH1基因报告系统,该系统在SK-N-SH细胞内因与miR-21相结合而呈表达“关闭”状态,antogomiR-21可通过抑制miR-21活性来“开启”报告基因表达,从而引起MRI信号变化。这为miR-21作为靶标的肿瘤早期诊断和基因治疗评价提供了一种潜在的无创性成像手段。