研究背景：近年来，随着许多新型、高效免疫抑制药物的开发和联合应用，使得多种脏器移植后长期存活率大大提高，器官移植已不仅是机体重要器官终末期疾病的治疗措施，也成为了满足提高生活质量愿望的治疗手段之一，如角膜移植、肢（指）体移植、“换脸”等等。但由于器官长期保存较为困难，就限制了器官移植的开展，使供体缺乏的矛盾越来越突出，大批待移植患者在等待中死亡。另外，在临床上经常遇到肢（指）体离断伴有重要脏器损伤、为抢救生命而暂时放弃再植，以及因心理、经济或社会等原因而暂时不能再植等现象，等到需要再植时，离断的肢（指）体已经变性坏死。如何解决组织器官长期保存、进而解决器官供体与受体之间的“地域差”与“时间差”，减少对已经匮乏的器官资源的浪费，是广大医务人员特别是器官移植工作者所面临的任务之一。器官得到长久保存，可以有充裕的时间使待移植器官找到与之配型良好的受体，医生也可有充足时间选择在自身与患者状态最好时进行器官移植手术。目前，深低温冷冻保存被公认为是组织与器官长期保存最有效的方法。肢（指）体等器官深低温保存成功，将会为自体组织器官移植（上述常见原因而未能Ⅰ期回植）和同种异体器官（肢体）的移植提供更广阔的前景。现在，人们已经能够将人体骨髓干细胞、血液、肌腱、精子、胚胎、胰岛、角膜、皮肤及动物的卵巢等进行成功的深低温保存。2002年12月，王增涛等成功再植一例在液氮中保存了81天的断指，从而证实了临床长期深低温保存断指成功的可行性，术后也恢复了较好功能，但指端出现萎缩现象；另外，临床上和动物实验时经常可以观察到，血管吻合再通后反复出现移植器官或再植肢（指）体循环障碍，但探查吻合口却未见异常，考虑这些均与再植后的“二次”损伤（主要是缺血再灌注损伤）有密切关系。研究表明，经深低温冻存的组织或器官，虽然能保持一定的生物活性，但在冷冻过程中也会造成组织器官一定程度的损伤，即低温损伤；并且，这种损伤随着血流的恢复，还会使组织器官（肢体）遭受更为严重的损害，即缺血再灌注损伤：以上两种损伤中，前者可导致细胞膜蛋白复合体的破坏和膜的分解，后者主要破坏生物膜中的不饱和脂肪酸，引发膜脂质过氧化反应，导致细胞受损。从某种意义上讲，缺血再灌注损伤是低温损伤的“叠加和增强”，这将直接影响器官移植或肢（指）体再植的成活和功能的发挥。再植肢体中以骨骼肌对缺血再灌注损伤最为敏感，再灌注后其所发生的损伤也最严重，因此，骨骼肌再灌注损伤的研究已成为肢体缺血再灌注损伤研究的热点。目前，对深低温冻存肢（指）体再植后缺血再灌注损伤的研究很少，尤其是对属于复合组织的肢体，其深低温冷冻保存缺血再灌注损伤的研究尚缺乏报道。为此，我们在对缺血再灌注损伤机制研究的基础上，结合大鼠后肢血管的解剖特点，建立了经深低温冻存大鼠断肢再植（自体）骨骼肌缺血再灌注损伤模型，可最大限度地减少免疫反应等其他因素的干扰，通过检测有关生化指标以及形态学观察，能更好地研究冻存肢体再植后缺血再灌注损伤的机制及其防治措施，为临床用药提供理论依据。本课题研究内容分四个部分：第一部分：大鼠肢体深低温冷冻后组织学的病理变化研究目的：通过本实验为肢体长期深低温保存，进而为深低温冷冻肢体再植成功的可行性研究提供形态学依据。方法：取健康成年雄性Wistar大鼠8只，体重500～600g，将左后肢设为正常对照组，右后肢设为冷冻组。用3％戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉（30mg／kg.b.w）。将双后肢均于膝关节上离断，迅速行右后断肢深低温冷冻前处理，程序降温，再移入液氮保存；实验时取出断肢并置于恒温水浴箱快速复温（6 min），然后分别切取大腿内侧皮肤、股血管、股神经、腓肠肌等组织块，制作组织切片，并与左侧后肢各相应组织切片作形态学对比分析。结果（1）大体形态观察：冷冻组肢体各组织块经复温后，色泽稍淡，轻度水肿，柔软度、弹性等与正常对照组比较无明显差别。（2）组织学观察：冷冻后各组织切片显示：①皮肤：部分表皮细胞核固缩，角化层部分脱落，真皮水肿。②血管：内膜不完整，内弹力膜部分断裂，部分管壁平滑肌细胞核固缩、扭曲，间质水肿。③神经：神经束内、神经纤维之间明显水肿。④骨骼肌：部分肌纤维细胞核固缩，间质水肿，横纹模糊。结论（1）经灌注冷冻保护液、梯度降温、深低温保存的皮肤、血管、神经、骨骼肌组织仍能保持一定程度的细胞结构完整性，一旦给予恢复细胞代谢活动的条件，可望能恢复其生命活动。（2）本实验通过对冻存大鼠肢体各组织的形态学观察，可对冻存后断肢组织的活性作出初步评估，并能为断肢的再植成功提供形态学依据。第二部分：深低温保存大鼠肢体骨骼肌再灌注损伤模型的建立及意义目的：建立一种大鼠肢体深低温保存、再灌注损伤动物模型，进行深低温保存断肢再植后骨骼肌缺血再灌注损伤的研究。方法（1）实验一：取健康成年雄性Wistar大鼠12只，体重500～600g，行腹腔内注射麻醉（30mg／kg.b.w）。首先显露并切取一段长约0.5cm股动静脉，10％甲醛液固定，石蜡包埋，切片，HE染色，观测股动静脉管壁结构及其厚度。然后采用经胸主动脉乳胶灌注方法，测量大鼠股动、静脉的外径及长度，同时观察其分支、走向及分支间距离，为肢体截肢平面的选择、断肢的冷冻处理及再植的顺利完成提供理论依据。（2）实验二：取健康成年雄性Wistar大鼠72只，体重500～600g，行腹腔内注射麻醉（30mg／kg.b.w），随机分为A、B、C、D、E、F六组，每组12只。依照实验一所提供的有关数据，均自右腹股沟下缘沿股血管走向作切口，显露股动静脉及其分支血管，自旋髂浅支下缘平面结扎股动静脉，再迅速自此平面离断肢体；然后将断肢依不同分组情况作相应处理后再植于左后肢（将右断肢皮肤与左侧肢体皮肤缝合固定，右断肢股动脉直接与左股动脉端端吻合，股静脉与左股静脉采用套管法端端吻合），恢复肢体血供4 h后取材进行指标检测。正常对照组（A组）：显露股动静脉只穿线而不结扎，直接取材；常温缺血再灌注组（B组）：将右断肢在室温下旷置2.5 h后行再植术，然后取材；常规深低温冻存组（C组）：右侧断肢经深低温冻存前处理，移入液氮容器内保存1个月，实验时将肢体复温、常规洗脱液灌洗后行断肢再植（取出断肢相对应大鼠），然后取材：依达拉奉小、中、大剂量三组（依次设为D、E、F组），均经深低温冷冻保存（同C组处理）；实验时将肢体复温，再分别应用含低、中、高剂量依达拉奉的洗脱液进行肢体灌洗，再行断肢再植术（取出断肢相对应大鼠），然后恢复肢体血供4 h后取材。结果：大鼠股动静脉及分支相关解剖数据：大鼠股动脉是髂外动脉沿大腿内侧的直接延续（一般指起始于腹股沟韧带到分出胭动脉为止的一段血管），其长度为（19.39±0.72）mm，中段外径为（0.9±0.13）mm，管壁厚度为（235.83±19.87）μm，其分支自上而下依次为：旋髂浅支、肌支、腹壁浅支、膝最上支、隐支、股深支及穿支。其中，后三个分支供应膝部及以远血供。肌支大约在股动脉远端1／3处发出，起点位于腹股沟韧带下方（9.07±0.52）mm；腹壁浅支位于腹股沟韧带下方（11.46±0.55）mm；膝最上支起点位于腹股沟韧带下方（13.72±40.71）mm；腘动脉则为股动脉的直接延续。膝最上支血管与肌支血管间距为（4.65±0.37）mm；肌支与旋髂浅支血管间距为（2.39±0.32）mm。股静脉与股动脉伴行，管壁特别薄而柔软，弹性小，管璧三层结构分界不明显，中膜的平滑肌不如动脉，肌纤维分布稀疏，血管内、外弹性膜不明显，易塌陷，中段外径为（1.10±0.12）mm，管壁厚度为（107.50±19.25）μm。结论（1）制作断肢模型时，截肢平面应选择在膝最上动脉上至少约6mm处，以尽量多的保留断肢股动、静脉长度。（2）为了使各组热缺血时间尽量保持一致，可将常温下缺血再灌注组在室温下放置约2.5 h后行再植术。（3）鉴于股静脉解剖特点，用套管法吻合股静脉简单易行，费时短、通畅率高。（4）因本实验模型是保持肢体再灌注4h即可取材，不必行断肢骨骼内固定及肌肉缝合，只需固定断肢皮缘（皮下组织）即可。（5）大鼠肢体深低温冻存再植后缺血再灌注损伤动物模型制作简单，短时间内便于护理，模型稳定、安全、实用，是一种研究骨骼肌再灌注损伤的较理想的急性实验动物模型，由于本模型为自体移植，它排除了免疫排斥反应等因素，最大限度地减少了各种干扰因素的影响，能更好的研究深低温保存骨骼肌再灌注损伤的机制及其保护措施。第三部分：深低温保存大鼠肢体骨骼肌再灌注损伤的研究目的：利用深低温保存大鼠肢体再灌注损伤动物模型，对常温下与深低温冻存肢体再植后骨骼肌缺血再灌注损伤的病理变化进行比较、研究，初步探讨深低温冻存大鼠肢体再灌注损伤的机制，为临床防治提供理论依据。方法：选取健康成年雄性Wistar大鼠36只，体重500～600g，随机分为三组，每组12只。分别设为正常对照组（A组）、常温缺血再灌注组（B组）、常规深低温冻存组（C组）。依据第二部分建立的深低温冻存大鼠肢体再灌注损伤动物模型，即：A组只显露右股动、静脉而不结扎、离断肢体，直接取材（取静脉血和右小腿腓肠肌组织）；B组和C组均自旋髂浅支平面迅速离断右后肢；其中，对B组断肢可将其置于室温2.5h后，再与左股动静脉吻合，恢复血供4h后取材（同A组）。对C组，经深低温冻存前处理，最后移入液氮容器中保存；实验时取出断肢，快速复温，自股动脉插管行洗脱液灌洗，然后再将断肢股动、静脉与左后肢股动、静脉吻合，恢复血供4h取材（同A组）。对以上三组，均测定每份动物血浆乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸磷酸激酶（CPK）含量，测定骨骼肌组织湿干重比值（W／D）、肌细胞膜Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca⁺-ATP酶活性以及骨骼肌丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、髓过氧化物酶（MPO）活性，观察骨骼肌的形态学改变，以探讨常温缺血再灌注组与常规深低温冻存组骨骼肌缺血再灌注损伤程度的差异。结果（1）与A组相比较，B、C组血浆LDH、CPK及骨骼肌W／D、MDA和MPO均高于A组（P＜0.05），骨骼肌组织中SOD及肌细胞膜Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca⁺-ATP酶活性均低于A组（P＜0.05）。（2）与B组相比较，C组中血浆LDH、CPK及骨骼肌W／D、MDA和MPO均高于B组（P＜0.05），骨骼肌细胞膜Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca⁺-ATP酶活性均低于B组（P＜0.05），而SOD活性变化无统计学差异（P＞0.05）。（3）骨骼肌组织切片：A组肌纤维基本正常，间质无水肿，未见炎细胞浸润，横纹较清晰：B组肌纤维轻度崩解，血管扩张、间质水肿，炎细胞浸润，横纹稍紊乱；C组肌纤维结构紊乱，有断裂，间质水肿，有较多炎性细胞浸润，横纹模糊。（4）透射电镜：A组肌原纤维较整齐，Z线清晰，线粒体嵴致密，膜完整，无肿胀。B组肌原纤维较整齐，Z线稍模糊，线粒体肿胀，嵴较紊乱，部分空泡化。C组肌原纤维部分断裂，Z线较模糊，线粒体明显肿胀，嵴紊乱，部分空泡化。结论（1）缺血再灌注损伤是一个多因素参与、多机制损伤的过程，肢体缺血再灌注损伤病理过程涉及肢体及其以外的多个脏器，可以说是整个机体的综合损伤过程。（2）深低温在一定条件下可以保存组织细胞的活性，但同时也会对组织细胞造成不同程度的损伤，当冻存断肢再植后恢复血供（再灌注）时，肢体会发生较常温下更为严重的缺血再灌注损伤。考虑这可能是在低温损伤的基础上，叠加了缺血再灌注损伤，这种双重损伤更易导致血管内皮细胞严重受损、使缺血组织（断肢）中的微血管阻塞，血流减少或阻断，致使缺血加重，即发生更为严重的再灌注损伤。但更详细的发病机制有待进一步研究。第四部分：依达拉奉对深低温保存大鼠肢体骨骼肌再灌注损伤干预的实验研究目的：利用第二部分建立的深低温冻存大鼠肢体再灌注损伤动物模型，探讨冻存肢体再灌注损伤对大鼠骨骼肌细胞膜和骨骼肌线粒体的影响，评价依达拉奉对缺血再灌注损伤骨骼肌细胞膜和线粒体的保护作用及其机制。方法：选取健康成年雄性Wistar大鼠60只，体重500～600g，随机分为5组，依次为正常对照组（A组）、常规深低温冻存组（C）、依达拉奉小剂量组（D）、依达拉奉中剂量组（E）、依达拉奉大剂量组（F），每组12只。建立深低温冻存大鼠肢体再灌注损伤模型。A组仅显露右股动、静脉而不结扎、离断肢体，直接取材（右侧腓肠肌组织）；C、D、E、F组均自大腿中上段（旋髂浅支下缘平面）离断右后肢，对断肢进行深低温冷冻保存处理并移入液氮容器中冻存；实验时取出冻存肢体，恒温水浴箱快速复温、灌注洗脱液；其中依达拉奉组（D、E、F组）分别采用含依达拉奉0.1mg／kg.b.w、0.3mg／kg.b.w、0.5mg／kg.b.w的洗脱液进行肢体灌注，然后行自体断肢再植（取出相对应大鼠），恢复肢体血供4h后取材（右侧腓肠肌组织）；对以上各组，皆检测腓肠肌丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、髓过氧化物酶活性（MPO）、肌细胞膜荧光偏振度（P）和膜Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶活性变化，并且提取骨骼肌线粒体，测定线粒体丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、呼吸控制率（RCR）以及光镜观察各组骨骼肌组织的结构变化和对骨骼肌超微结构进行透射电镜检测。结果（1）与A组相比较：C、D、E组骨骼肌中MDA含量高于A组（P＜0.05），SOD活性及RCR低于A组（P＜0.05），而F组MDA含量、SOD活性及RCR变化无统计学差异（P＞0.05）：C、D组荧光偏振度高于A组（P＜0.05），而E、F组荧光偏振度的增加无统计学差异（P＞0.05）；C、D、E、F各组中MPO、线粒体MDA高于A组（P＜0.05），各组骨骼肌肌细胞膜Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶及线粒体SOD低于A组（P＜0.05）。（2）与C组比较：E、F组骨骼肌SOD活性、线粒体SOD活性及RCR高于C组（P＜0.05），而D组中上述各指标变化则无统计学差异（P＞0.05）；D、E、F各组中骨骼肌肌细胞膜Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶高于C组（P＜0.05），骨骼肌中MDA含量、线粒体MDA、MPO及荧光偏振度低于C组（P＜0.05）。（3）与D组比较：F组骨骼肌SOD活性、线粒体SOD及细胞膜Na⁺-K⁺-ATP酶高于D组（P＜0.05），MPO、线粒体MDA含量低于D组（P＜0.05）；E、F各组中骨骼肌肌细胞膜Ca²⁺-ATP酶高于D组（P＜0.05），骨骼肌中MDA含量低于D组（P＜0.05）；而荧光偏振度及RCR变化则无统计学差异（P＞0.05）。（4）与E组比较：仅F组骨骼肌肌细胞膜Na⁺-K⁺-ATP酶高于E组（P＜0.05），余各指标变化均无统计学差异（P＞0.05）。（5）骨骼肌组织切片：A组肌纤维横纹清晰，间质无水肿；C组肌纤维结构紊乱，有断裂，肌间隙增宽明显，间质水肿，有较多量炎性细胞浸润；而D组肌纤维轻度崩解，间质稍水肿，炎细胞浸润；E组骨骼肌间质稍水肿，横纹模糊，有少量炎细胞浸润：F组骨骼肌间质稍水肿，肌间散在炎细胞浸润，少量灶性充血。（6）透射电镜观察：A组：肌原纤维排列较整齐，Z线清晰，线粒体嵴致密，膜完整，无肿胀；C组：肌原纤维排列部分断裂，Z线较模糊，线粒体明显肿胀，嵴紊乱，部分空泡化，间质水肿；而依达拉奉组骨骼肌损伤程度明显轻于C组，表现为：肌原纤维排列较整齐，Z线清晰，线粒体轻度肿胀，膜较完整，嵴存在，但部分紊乱、部分空泡化。结论（1）经深低温冻存肢体再植前应用含依达拉奉洗脱液进行断肢灌注，可以明显减轻骨骼肌再灌注损伤，其机理可能是依达拉奉通过清除自由基，抑制了膜脂质过氧化反应，对肢体骨骼肌细胞膜及线粒体具有保护作用。（2）对于该药物用于防治冻存肢体缺血再灌注损伤的最佳用量有待进一步研究。