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铝是地壳中含量最多的金属元素,因其良好的理化特性被广泛应用于食品加工、饮用水净化和铝制炊具生产等过程,导致人类暴露于铝环境中。研究已证实铝对人体多个系统具有毒性效应,其中铝引起的神经毒性效应尤为突出。研究表明铝诱导神经细胞凋亡是铝发挥神经毒性效应的重要途径,然而铝诱导神经细胞凋亡的分子调控机制目前尚不十分清楚。麦芽酚是一种常见的膳食成分,它在人体胃肠道内能与铝形成可溶性铝复合物,并可促进铝通过血脑屏障进入脑组织,因此麦芽酚铝是近年来铝神经毒性研究理想的铝化合物。microRNAs（miRNAs）是一类短链非编码RNA,它们通过调控基因转录后的表达水平进而参与人体多种生理过程。越来越多的研究表明,miRNAs在维持神经系统功能和调控神经细胞生理过程中发挥重要作用。miR-19是miR-17-92簇的关键成员,研究表明miR-19通过靶向于多个细胞凋亡相关基因（如PTEN）在细胞凋亡调控过程中发挥重要作用,然而miR-19在神经细胞凋亡及在铝诱导神经细胞凋亡中的作用迄今未见研究报道。叶酸是一种水溶性维生素,它是具有神经保护效应的膳食营养素,足量的叶酸供给能够预防多种神经系统疾病。研究表明叶酸可通过抑制神经细胞凋亡进而发挥神经保护效应,然而其抑制神经细胞凋亡的分子调控机制目前尚未完全阐明,如上所述,miR-19在细胞凋亡中发挥重要作用,然而miR-19是否在叶酸改善神经细胞凋亡中发挥调控作用尚未见报道。本项研究拟采用体外SH-SY5Y神经细胞麦芽酚铝染毒模型和体内SD大鼠麦芽酚铝染毒模型相结合的方法,在领域内创新性地探讨miR-19在铝诱导神经细胞凋亡中的作用及其机制,并在此基础上进一步研究叶酸能否通过调控miR-19进而在铝诱导的神经细胞凋亡过程中发挥保护效应。本研究将为阐明铝诱导神经细胞凋亡的分子调控机制提供新的科学依据,同时也为揭示叶酸神经保护效应的分子调控机制提供新的视角。第一部分 miR-19在铝诱导神经细胞凋亡中的作用及其机制的研究目的:建立体外SH-SY5Y神经细胞和体内SD大鼠麦芽酚铝染毒模型;研究麦芽酚铝对神经细胞凋亡的影响;观察miR-19及其下游PTEN/AKT/p53信号通路在麦芽酚铝诱导神经细胞凋亡中的变化;探究miR-19在麦芽酚铝诱导神经细胞凋亡中的调控作用。方法:不同浓度麦芽酚铝处理SH-SY5Y神经细胞72h;MTT法测定麦芽酚铝对SH-SY5Y细胞活力的影响;Hochest 33258染色和流式细胞凋亡检测法观察麦芽酚铝对神经细胞凋亡的影响;Western blotting测定SH-SY5Y细胞内caspase家族、Bcl-2家族和PTEN/AKT/p53信号通路相关蛋白表达水平的变化;Real-time PCR测定麦芽酚铝对miR-19a和miR-19b表达水平的影响。SH-SY5Y细胞转染miR-19 mimics,并用麦芽酚铝处理72h;MTT法测定神经细胞活力的变化;流式细胞凋亡检测法观察转染miR-19 mimics对麦芽酚铝诱导神经细胞凋亡的影响;Western blotting 测定 SH-SY5Y 细胞内 caspase 家族、Bcl-2 家族和PTEN/AKT/p53信号通路蛋白表达水平的改变。不同浓度麦芽酚铝（20、100和200 mg/L Al）饮水途径染毒SD大鼠12周;石墨炉原子吸收法测定麦芽酚铝暴露对SD大鼠脑组织和血清铝含量水平的影响;Western blotting测定麦芽酚铝对大鼠脑组织中cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9表达水平的影响;TUNEL细胞凋亡检测法测定麦芽酚铝对SD大鼠海马组织中神经细胞凋亡的影响;Real-time PCR检测麦芽酚铝对大鼠脑组织内miR-19a和miR-19b表达水平的影响;Western blotting检测麦芽酚铝对大鼠脑组织中PTEN/AKT/p53信号通路蛋白表达水平的影响;免疫组化法观察麦芽酚铝对大鼠海马组织中miR-19靶基因PTEN表达水平的影响。结果:1、麦芽酚铝诱导SH-SY5Y神经细胞凋亡用不同浓度麦芽酚铝处理SH-SY5Y神经细胞72h;结果显示,麦芽酚铝剂量依赖性地降低SH-SY5Y细胞活力;Hocest 33258染色发现,与对照组相比,麦芽酚铝处理组细胞核内染色质固缩,部分高浓度处理组细胞核碎裂;流式凋亡检测结果显示,麦芽酚铝处理SH-SY5Y细胞72h可引起神经细胞凋亡率的显著升高;同时Western blotting结果显示,麦芽酚铝可下调SH-SY5Y细胞内pro-caspase-9和pro-caspase-3 的表达并上调活性形式 cleaved-caspase-9 和 cleaved-caspase-3 的表达;上述结果表明麦芽酚铝可诱导SH-SY5Y神经细胞凋亡。2、麦芽酚铝下调miR-19的表达并改变miR-19下游PTEN/AKT/p53通路活性分别用0.1、0.25和0.5mM麦芽酚铝处理SH-SY5Y神经细胞72h;Real-time PCR结果显示,麦芽酚铝显著下调SH-SY5Y细胞内miR-19a和miR-19b的表达水平;Western blotting分析显示,麦芽酚铝可上调miR-19靶基因PTEN的蛋白表达,下调磷酸化AKT（p-AKT）的表达,并激活p53和Bax,抑制Bcl-2的活性;上述结果表明麦芽酚铝可下调miR-19的表达并改变miR-19下游PTEN/AKT/p53通路的活性。3、过表达miR-19抑制麦芽酚铝诱导的SH-SY5Y神经细胞凋亡在SH-SY5Y细胞中转染miR-19 mimics或空载mimic,并用0.25mM麦芽酚铝处理细胞72h;结果显示,转染miR-19a和miR-19b mimics分别显著上调miR-19a和miR-19b的表达水平;过表达miR-19a或miR-19b可显著抑制麦芽酚铝诱导的SH-SY5Y细胞活力下降;流式凋亡检测显示,转染miR-19a或miR-19b mimics,麦芽酚铝诱导的神经细胞凋亡率由18.1%分别降低至9.8%和9.5%;Western blotting结果表明,过表达miR-19a或miR-19b可抑制麦芽酚铝激活caspase-9和caspase-3的表达;过表达miR-19也能完全或部分逆转由麦芽酚铝引起的PTEN/AKT/p53通路蛋白表达水平的改变;综上结果表明miR-19在麦芽酚铝诱导神经细胞凋亡中发挥重要调控作用。4、麦芽酚铝升高SD大鼠脑铝和血清铝含量麦芽酚铝（20、100和200mg/L Al）饮水途径染毒雄性SD大鼠12周,SD大鼠的体重、摄食量、饮水量、铝摄入量、脑铝含量和血清铝含量被记录和测定;结果显示,SD大鼠的体重在各实验组间没有明显差异;高剂量组的饮水量和进食量较对照组有一定程度的下降,但差异不具有统计学意义;20、100和200 mg/LAl染毒组大鼠每日铝暴露水平分别是1.73、8.49和15.77 mg/kgbw;石墨炉原子吸收法测定结果显示,与对照组相比,麦芽酚铝染毒组大鼠脑组织和血清中的铝含量水平显著升高;上述结果表明经口途径摄入的铝在体内经过代谢后可进入血液和脑组织。5、麦芽酚铝诱导SD大鼠脑神经细胞凋亡不同浓度麦芽酚铝饮水途径染毒SD大鼠12周,分离脑组织并用于Western boltting分析和TUNEL细胞凋亡检测。结果显示,麦芽酚铝染毒可上调大鼠脑组织中cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3的蛋白表达水平,表明麦芽酚铝激活了 caspase凋亡信号通路;并且麦芽酚铝染毒可引起大鼠神经细胞核内DNA链的断裂,说明麦芽酚铝引起了神经细胞凋亡改变;上述结果表明麦芽酚铝可诱导大鼠神经细胞凋亡。6、麦芽酚铝下调SD大鼠脑组织miR-19的表达并改变miR-19下游PTEN/AKT/p53通路活性麦芽酚铝染毒SD大鼠12周;Real-time PCR结果显示,麦芽酚铝显著下调大鼠脑组织中miR-19a和miR-19b的表达水平;Western blotting结果显示,麦芽酚铝能上调大鼠脑组织中miR-19靶基因PTEN的蛋白表达水平,下调p-AKT的表达,升高转录因子p53和促凋亡蛋白Bax的活性并降低抗凋亡蛋白Bcl-2的活性;免疫组化的结果验证了麦芽酚铝可升高大鼠海马组织中PTEN的表达水平;上述结果表明麦芽酚铝也可下调大鼠脑组织中miR-19的表达并改变miR-19下游PTEN/AKT/p53通路的活性。结论:体外和体内研究结果表明麦芽酚铝可通过下调miR-19进而改变miR-19下游PTEN/AKT/p53信号通路活性诱导神经细胞凋亡;本研究首次发现miR-19在麦芽酚铝诱导神经细胞凋亡中发挥关键作用,为阐明铝诱导神经细胞凋亡的分子调控机制提供了新的科学依据。第二部分 miR-19在叶酸改善铝诱导的神经细胞凋亡中的作用及其机制的研究目的:建立体外麦芽酚铝染毒SH-SY5Y神经细胞模型并用叶酸进行干预;观察叶酸对麦芽酚铝诱导的神经细胞凋亡是否具有保护效应;探讨叶酸神经保护效应的分子机制。方法:用1、10和100 μmol/L叶酸单独处理SH-SY5Y细胞72h;MTT法观察叶酸单独处理对SH-SY5Y细胞活力的影响。0.25mM麦芽酚铝单独或联合10μmol/L叶酸处理细胞72h,MTT法观察SH-SY5Y神经细胞活力的变化;Real-time PCR测定法分析麦芽酚铝单独或联合叶酸处理对miR-19a和miR-19b表达水平的影响;Western blotting测定caspase家族、Bcl-2家族和miR-19下游PTEN/AKT/p53信号通路蛋白表达水平的变化。在SH-SY5Y细胞中单独转染miR-19 inhibitors;MTT法测定转染miR-19 inhibitors对神经细胞活力的影响;Western blotting 测定转染 miR-19 inhibitors 对 caspase 家族、Bcl-2 家族和PTEN/AKT/p53通路蛋白表达水平的影响。转染或不转染miR-19 inhibitors,麦芽酚铝单独或联合叶酸处理SH-SY5Y细胞72h;MTT法测定SH-SY5Y细胞活力的变化;Western blotting测定caspase家族和PTEN/AKT/p53通路蛋白表达水平的变化。结果:1、叶酸改善麦芽酚铝诱导的SH-SY5Y神经细胞凋亡用1、10和100μmol/L叶酸单独处理SH-SY5Y细胞72h,结果显示,叶酸单独处理对神经细胞活力无明显影响,然而用相同浓度的叶酸与麦芽酚铝联合处理SH-SY5Y细胞72h,结果显示,叶酸可显著改善麦芽酚铝引起的细胞活力下降;Western blotting结果显示,麦芽酚铝单独处理可下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bax的表达,并激活caspase-9和caspase-3,而叶酸可完全或部分逆转由麦芽酚铝引起的以上凋亡蛋白表达水平的改变;上述结果表明叶酸对麦芽酚铝诱导的神经细胞凋亡具有保护效应。2、叶酸抑制麦芽酚铝诱导的miR-19表达下调麦芽酚铝单独或联合叶酸处理SH-SY5Y细胞72h;结果显示,麦芽酚铝单独处理显著下调SH-SY5Y细胞内miR-19a和miR-19b的表达水平,而叶酸可显著改善麦芽酚铝诱导的miR-19a和miR-19b的表达下调;麦芽酚铝单独处理能上调miR-19靶基因PTEN的表达,下调p-AKT的表达,并激活p53;而与叶酸联合处理可改善麦芽酚铝引起的PTEN/AKT/p53通路蛋白表达水平的改变;上述结果提示miR-19/PTEN/AKT/p53可能在叶酸抗凋亡的神经保护效应中发挥调控作用。3、抑制miR-19表达可诱导SH-SY5Y神经细胞凋亡在SH-SY5Y细胞中单独转染miR-19 inhibitors并培养72h;结果显示,转染miR-19a和miR-19b inhibitors分别显著下调miR-19a和miR-19b的表达水平;miR-19a或miR-19b的表达下调均可引起SH-SY5Y细胞活力的下降,并导致SH-SY5Y细胞内PTEN、p53和Bax的表达上升,Bcl-2的表达下降,caspase-9和caspase-3的激活;上述结果表明抑制miR-19可改变其下游凋亡相关蛋白的活性进而诱导SH-SY5Y神经细胞凋亡。4、叶酸调控miR-19/PTEN/AKT/p53通路改善麦芽酚铝诱导的神经细胞凋亡在转染或不转染miR-19 inhibitors两种细胞模型中,麦芽酚铝单独或联合叶酸处理SH-SY5Y细胞72h;结果显示,叶酸可显著改善麦芽酚铝引起的细胞活力下降,而这种改善作用在转染miR-19 inhibitors后显著受到抑制;在不转染miR-19 inhibitors的细胞中,叶酸可对麦芽酚铝引起的PTEN、p-AKT、p53、caspase-9和caspase-3表达活性改变发挥调控作用,改善麦芽酚铝诱导的细胞凋亡;而在转染miR-19 inhibitors的细胞中,叶酸以上的调控作用明显减弱或消失;上述结果表明miR-19/PTEN/AKT/p53通路在叶酸神经保护效应中发挥调控作用。结论:本研究首次发现叶酸通过调控miR-19/PTEN/AKT/p53通路活性进而对麦芽酚铝诱导的神经细胞凋亡发挥保护效应,为揭示叶酸神经保护效应的分子机制提供了新的视角。