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鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus，CIAV)是引起家禽免疫抑制病的一种重要病原体。该病在世界主要养禽国家都有报道,已在世界范围内广泛分布,给养禽业带来巨大经济损失。本论文就鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及CIAV-CZC1602的全基因测序、鸡传染性贫血病毒VP3蛋白原核表达载体的构建以及抗CIAV-VP3蛋白单克隆抗体的研制三个方面展开研究,对CIAV流行规律、遗传变异以及检测方法建立具有重要意义。1、鸡传染性贫血病毒的分离鉴定以及CIAV-CZC1602株的遗传演化分析本研究对江苏地区养殖场内发生的疑似鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染病例以及疑似污染有CIAV的疫苗进行检测与诊断。首先对送检病例及疫苗进行了 CIAV病毒特异性DNA片段的PCR扩增。然后将PCR阳性组织样品及疫苗样品处理后接种CIAV易感细胞MDCC-MSB1细胞进行了病毒分离。成功分离到了四株CIAV病毒,分别命名为CIAV-CZC1602,CIAV-LHC1710,CIAV-HJC1709 和 CIAV-YC1711。同时为了解 CIAV 分离株的全基因变异情况,对CIAV-CZC1602的全基因进行了测序并对其遗传进化进行分析。结果表明,CIAV-CZC1602毒株基因组全长为2298bp,与NCBI上发表的21株CIAV毒株序列比较发现,核苷酸同源性在96.1%~99%之间。全基因系统发育进化树分析显示,该毒株与北京株的亲缘关系最近。2、鸡传染性贫血病毒VP3蛋白原核表达载体的构建及其表达验证本研究参考Genbank发表的CIAV cux-1毒株的基因序列(登陆号:M55918),设计了一对针对CIAV-VP3的特异性引物,用PCR的方法从CIAV基因组中成功扩增出了 VP3基因。同时设计一对针对pGEX-6p-l载体的线性化引物,用PCR的方法将pGEX-6p-l载体线性化。将CIAV-VP3基因片段与pGEX-6p-l载体线性化产物按照一步克隆法进行连接转化后成功的构建了 pGEX-6p-l-VP3重组表达菌,经IPTG诱导表达后,获得大小约35kDa的GST-VP3重组蛋白,重组蛋白具有良好的抗原性。GST-VP3重组蛋白的获得为抗CIAV-VP3单克隆抗体的制备提供了良好的生物材料。3、鸡传染性贫血病毒CIAV-VP3蛋白单克隆抗体的研制本研究以原核表达的GST-VP3重组蛋白作为免疫原,对Balb/c小鼠进行免疫,然后采集其脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,制备针对CIAV-VP3蛋白的单克隆抗体。通过建立间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)的双重筛选方法,成功筛选到了 2株针对CIAV-VP3 ’蛋白不同抗原表位的杂交瘤细胞株,分别将其命名为CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8。经过亚类鉴定试剂盒鉴定,两株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体类型均为IgG1,Kappa链。Western blot 试验证实,单抗 CIAV-VP3-4D7 和 CIAV-VP3-4G8 均能与 GST-VP3 重组蛋白反应,而与GST蛋白不反应。间接免疫荧光试验证明,单抗CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均能识别在转染了 pcDNA3.1-VP3的DF-1细胞中表达的CIAV-VP3。单抗CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8的获得为CIAV-VP3蛋白分子生物学特征研究以及开发基于VP3蛋白的CIAV诊断技术开发奠定了基础。