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结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,且其发病率与死亡率均呈持续上升趋势。针对这样的临床现状,一方面需要从分子水平完善结直肠癌发生的分子机制便于患者的早期诊断;另一方面需要深入解析治疗抵抗的分子机制,有利于新的靶向药物的识别与发现,或者联合现有治疗方式以提高患者的临床疗效。Wnt/β-cateinin信号通路通常在结直肠癌中呈组成性激活;肿瘤放化疗过程中常会伴随NF-κB信号通路的激活。在第一部分的研究中,我们研究了LRP16对Wnt/β-cateinin信号通路的调控作用;第二部分主要研究了 LRP16在直结肠癌中的肿瘤生物学功能,解析了 LRP16对DNA损伤诱导NF-κB信号通路激活的调控作用和分子机制,并筛选到可阻断LRP16-NF-κB信号通路的小分子化合物。方法:第一部分:我们首先通过western blot方法检测了少量结直肠癌临床样本中LRP16的表达情况,随后通过荧光素酶活性分析检测了 LRP16对Wnt/β-cateinin信号通路的调控作用,利用western blot方法检测β-cateinin磷酸化和总体水平变化,及下游靶基因的表达变化,通过免疫共沉淀技术检测了 LRP16 与 GSK3-β、β-cateinin、Axin、dv12、CK1 等蛋白的相互作用,最后通过免疫组化研究了 LRP16在102组结直肠癌临床标本中的表达情况;第二部分:首先通过组织芯片分析了 LRP16与NF-κB活性的关系;随后通过CCK-8、克隆形成、Annexin V标记与流式细胞计数等试验研究了LRP16在结直肠癌细胞中的生物学功能;在过表达或抑制LRP16表达后,利用western blot和荧光素酶活性分析检测了 LRP16对DAN损伤诱导的NF-κB活性的影响;利用质谱分析技术筛选了 LRP16相互作用蛋白,并通过免疫共沉淀和GST pull-down试验验证LRP16与PKR、IKKβ之间的相互作用;通过免疫荧光技术检测了 DNA损伤条件下LRP16在细胞内的分布变化;利用组织病理学方法和各种细胞和分子生物学技术,研究了 LRP16与PKR的协同作用及机制;最后通过分子对接筛选了竞争结合PAR的小分子化合物,并在细胞和动物水平确证了小分子化合物MRS2578的功能。结果:LRP16在部分结直肠癌标本中呈低表达,报告基因分析结果显示LRP16可以调控Wnt信号通路活性,过表达LRP16可以促进β-cateinin的磷酸化和降解,反之,β-cateinin水平升高;过表达LRP16可以抑制Wnt信号通路下游靶基因c-myc的表达;免疫共沉淀结果显示LRP16可与GSK3-β、β-cateinin、Axin、dv12、CK1等蛋白相互作用;大样本的免疫组化结果显示LRP16表达与结直肠癌进展呈正相关;组织芯片结果显示在结直肠癌标本中LRP16表达水平与NF-κB活性呈正相关,细胞水平的研究结果显示LRP16可以调控DNA损伤诱导的NF-κB活性,机制研究显示LRP16选择性地相互作用并激活双链RNA依赖性激酶(PKR),并且充当支架以帮助形成PKR-IKKβ的三元复合物,从而上调DNA损伤诱导的NF-κB活性。由于LRP16介导结直肠癌细胞抵抗DNA损伤药物的作用依赖于其PAR结合功能,我们筛选到小分子化合物MRS2578,体外结果证明MRS2578可以抑制LRP16与PKR和IKKβ的相互作用,动物实验结果显示,与单独的每种药物相比,同时使用MRS2578和依托泊苷在小鼠移植瘤中表现出协同的抗肿瘤效应。结论:LRP16可以调控Wnt信号通路,但是该调控方式在结直肠癌发生发展中可能没有生物学意义;LRP16可以通过PKR-NF-κB途径介导结直肠癌细胞抵抗DNA损伤药物,MRS2578可通过阻断LRP16-PKR-NF-KB激活,增加肿瘤细胞对DNA损伤剂的敏感性,该研究为提高肿瘤放化疗敏感性提供了一种新的途径。