性别决定是性腺发育和分化的基础。在地球上脊椎动物的整个系统进化历程中,鱼类是较为低等的脊椎动物,它分布最广泛,种类最多样,性别决定机制又具有原始性和可塑多样性,涵盖了迄今已知的所有脊椎动物的性别决定模式,因此鱼类具有承上启下的关键性地位。鱼类的性别表达分为性别决定和性别分化两个过程,二者有不同之处又有相似点。其中性别决定是静态的基因型决定因素,而性别分化则是动态的程序性发生,产生精卵巢以及第二性征的事件。这两个进程是相互作用与平衡,最终表现出功能、形态和行为的雌性或雄性。通常雌、雄性基因型即产生雌、雄性的表现型。然而低级别的脊椎动物,性腺发育分化中易受到外源因子的干扰,出现基因型与表现型的不统一。因此关于鱼类性别决定和性别控制技术的研究,因其性别决定和性腺分化机制的多样性和不稳定性而具有广阔的空间。牙鲆(Paralichthys olivaceus),隶属鲽形目(Pleuronectiforms),其肉质鲜嫩、生长快、抗病力强、经济价值高,是我国重要的海水养殖经济鱼类之一。在牙鲆养殖中,雌雄个体生长存在明显差异,雌性个体大而且生长快。在其性腺分化期,许多环境因子如温度、外源性激素等能影响其性腺分化,研究表明高温能诱导其仔鱼产生更多生理性雄鱼,而外源性激素也能使其发生性反转。因此,牙鲆是开展鱼类性别决定和性腺分化机制研究的良好动物模型。mi RNA存在于真核生物中,是一类参与基因转录后水平调控的非编码单链小分子RNA,长度很短,约18~24个核苷酸(个别不超过20个核苷酸)。广泛存在于动物、植物、线虫、人等各种生物中,具有高度的进化保守性、组织特异性。mi RNA是动物生长、发育、生殖、疾病发生中关键的调控因子,到目前其在牙鲆性别决定和性腺发育中的调控作用的相关研究还鲜有报道。本实验室先前建立了牙鲆精卵巢mi RNA文库,并通过第二代测序(NGS)技术和生物信息学方法鉴定了141个成熟mi RNA,筛选出一批在牙鲆雌雄性腺中不同或特异表达的mi RNA。在此基础上,本章挑选了2个差异表达大的mi RNA(pol-mi R-26a,26b),通过公共数据库的靶基因预测软件Pic Tar、Target Scan等预测出pol-mi R-26a,26b有多个靶m RNA,挑选出了其中和性别决定和性腺分化相关的emx1(empty spiracles homeobox1)以及重要的雄性性别决定候选基因dmrt1(Doublesex and mab-3-related transcription factor 1)。按照查询NCBI数据库,本章设计并合成了dmrt1 3’UTR片段的引物并进行PCR扩增,进行连接PCR得到的dmrt1 3’UTR和psi CHECK-2载体,构建野生型重组质粒;同时采用定点诱变法对dmrt1基因进行体外定点诱变,构建突变型重组质粒,将其分别转染进293T细胞中构建pol-mi R-26a,26b稳转细胞系,利用荧光素酶报告实验检测pol-mi R-26a,26b与其靶基因dmrt1的结合位点。结果表明:野生型质粒psi CHECK-dmrt1-3’UTR与pol-mi R-26a,26b mimics组的荧光素酶活性极显著低于psi CHECK-dmrt1-3’UTR与pol-mi R-26a,26b inhibitor组及blank和NC组(P<0.01)。表明pol-mi R-26a,26b能通过与dmrt1的3’UTR互补结合,切割降解靶基因从而使其荧光素酶活性减弱。接着本实验对emx1在牙鲆各组织和早期发育中的表达进行了研究。结果成功获得一长度为1127 bp的牙鲆emx1 c DNA序列,其中包括708 bp的开放阅读框,编码235个氨基酸。同源性比对发现,牙鲆emx1基因的氨基酸序列与雀鲷和花鳉同源性最高,为95%,与其它物种如斑马鱼、墨西哥脂鲤、原鸡、热带爪蟾、小鼠和人的同源性分别为87%、84%、83%、80%、72%和72%。系统进化树分析显示,牙鲆Emx1蛋白与鱼类Emx1紧密聚为一支。荧光定量PCR显示,emx1基因在牙鲆卵巢中的表达量丰富,精巢中次之,而在其他各组织的表达量则较低。emx1在从原肠胚到孵化后10 d的牙鲆早期发育中也发现了相对较高的表达,且在胚孔封闭和心跳期有最高的表达。该结果表明emx1基因很可能在牙鲆早期发育和生殖系统中发挥重要作用。为了探讨高温和外源性激素对牙鲆性腺分化期pol-mi R-26a,26b及其靶基因表达的影响,通过高温诱导和外源性激素处理性腺分化敏感期的牙鲆仔鱼,并利用荧光定量PCR技术分析了pol-mi R-26a,26b、dmrt1、emx1在各处理组牙鲆中的表达情况。实验分为17β-E2(17β-雌二醇)处理组、17α-MT(17α-甲基睾酮)处理组、28℃高温诱导组和对照组,结果显示:高温能加快牙鲆的生长速度,并且使鱼的雄性率达到88.72%;17α-MT和17β-E2均能诱导牙鲆性逆转。荧光定量PCR结果表明,pol-mi R-26a和26b的表达趋势较为一致,二者在高温诱导组和对照组的表达量较高,而在17α-MT和17β-E2处理组的表达量则较低。高温诱导后emx1在牙鲆性腺中的表达显著上调(P<0.05),但17α-MT和17β-E2处理对其表达量无显著影响。而dmrt1在高温诱导组和17α-MT处理组牙鲆性腺中的表达显著高于对照组,其中高温组中dmrt1的表达量是对照组的5.98倍(P<0.05);而17β-E2处理组中dmrt1的表达则最低。表明高温诱导鱼类向雄性化发育可能与高温能上调dmrt1基因的表达有关。此外,dmrt1在高温组的表达量高于雄激素组,这可能与高温组的牙鲆生长较快,其体长体重平均值均大于雄激素组有关。