【摘 要】
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黑色素在保护皮肤免受UV伤害和其他环境因素中至关重要,然而黑色素异常积累会导致类似雀斑和黄褐斑等严重皮肤病,甚至癌症。调控黑色素生成是治疗色素沉着过度性疾病的重要渠道。寻找特异抑制剂从而调控黑色素生成具有重要意义。而黑色素瘤的发生起源于皮肤组织的恶性实体肿瘤,有80%的皮肤相关疾病患者死亡与之相关,是最具攻击性的皮肤癌,恶性程度高,对人类健康的危害性不断增长。因此,开发治疗黑色素瘤的新型候选辅助药
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黑色素在保护皮肤免受UV伤害和其他环境因素中至关重要,然而黑色素异常积累会导致类似雀斑和黄褐斑等严重皮肤病,甚至癌症。调控黑色素生成是治疗色素沉着过度性疾病的重要渠道。寻找特异抑制剂从而调控黑色素生成具有重要意义。而黑色素瘤的发生起源于皮肤组织的恶性实体肿瘤,有80%的皮肤相关疾病患者死亡与之相关,是最具攻击性的皮肤癌,恶性程度高,对人类健康的危害性不断增长。因此,开发治疗黑色素瘤的新型候选辅助药物具有重要现实意义。腰果是常见的食品,腰果壳作为腰果加工生产过程中的副产物含有大量的腰果壳油（CNSL）。CNSL具备天然丰富、可生物降解和可再生等优质特性,但极少得到应用。Cardols/Cardanols是从天然CNSL中获得的5种活性酚类物质,在生物医药和化妆品生物活性应用中具有广阔前景。目前还未有关于CNSL提取物干扰黑色素生成及抗恶性黑色素瘤的研究报道。本论文从细胞和动物水平,以鼠源B16F10细胞和人源恶性黑色素瘤M14细胞为研究对象,探究Cardols/Cardanols活性物质调控黑色素生成及抗恶性黑色素瘤的作用机理。本论文首先优化建立了高纯度CNSL提取物的提取精炼和分离纯化的制备工艺,通过HPLC技术获得Cardols/Cardanols。以B16F10黑色素瘤细胞为产黑模型,发现Cardols/Cardanols能够干扰B16F10细胞的黑色素生成从而调控细胞颜色的深浅,抑制色素沉着,使产黑能力下降,抑制细胞内TYR活性,且显著下调α-MSH和Forskolin所诱导的黑色素生成。分子机制研究发现,Cardols/Cardanols抑制cAMP关键产物导致信号的转导阻碍,通过激活PI3K/Akt信号通路协同抑制α-MSH/cAMP/PKA和MAPK信号通路,从而调控MITF的表达,影响下游关键蛋白TYR、TYRP-1和TYRP-2表达,最终抑制黑色素生成。另一方面,CNSL提取物主要成分腰果酚（CM）能显著抑制M14人源恶性黑色素瘤细胞的体外增殖,抑制集落形成活力、细胞迁移和侵袭能力。同时诱导细胞周期阻滞在S期以抗癌细胞增殖生长。我们从定性和定量分析证实CM诱导M4细胞发生了凋亡,凋亡率达43.46%,出现经典的凋亡形态学特征。且CM诱导的M14细胞凋亡方式区别于细胞坏死方式和自噬方式,3-MA和Necrostatin-1均无法抑制CM所诱导的M14细胞死亡,但Z-VAD-FMK抑制了 CM诱导的M14细胞凋亡。进一步研究发现,细胞内ROS含量激增,P53激活,Bax/Bcl-2比值上调,线粒体结构改变,跨膜电位ΔΨm降低及Cytoc从线粒体释放与Apaf1结合,激活Caspase级联反应,PARP受切割,最终导致细胞死亡。CM通过ROS触发的线粒体介导的内源性途径,以剂量依赖性的方式诱导M14细胞发生凋亡作用。在动物水平上建立CNSL提取物对BALB/c裸小鼠恶性黑色素瘤移植瘤的动物模型,研究发现CNSL提取物明显地抑制黑色素瘤实体瘤的生长,未引起病理形态变化,国标急性经口毒性试验也表明安全无毒副作用。提取物依赖内源性线粒体相关信号通路诱导肿瘤组织内细胞发生凋亡,同时下调VEGF和PCNA的表达,达到抗肿瘤效应。总结上述研究,系统研究了 CNSL活性物质对黑色素生成调控及抗人源恶性黑色素瘤的生物学效应,对CNSL提取物的开发应用奠定了理论基础,为色素相关紊乱症及黑色素瘤治疗提供了应用思路和一定的理论依据。
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