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第一部分大鼠脑出血后脑组织中EPAC1、EPAC2的蛋白水平变化目的探讨大鼠脑出血（intracerebral hemorrhage,ICH）后 EPAC（exchange protein directly activated by cAMP）两个亚型EAPC1和EPAC2蛋白水平变化情况。方法1.实验动物分组:随机分配54只SD大鼠（成年,雄性）到9个组中,包括:正常组,假手术组和7个ICH组,ICH组分为ICH后3小时,6小时,12小时,24小时,48小时,72小时和7天这七个亚组。2.体内ICH模型的建立:通过立体定向仪将动脉血（抽取大鼠自体心脏动脉血）注入大鼠尾状核。假手术组中,仅用注射针穿刺脑组织形成穿刺隧道但不注血。3.体外ICH模型的建立和分组:在神经元细胞中加入OxyHb（10μM）建立ICH体外模型。一共分为六组,分别是正常组和加入OxyHb后3小时组、6小时组、12小时组、24小时组、48小时组。4.检测方法及指标:使用Westem-blot方法检测体内和体外ICH模型中,各组蛋白样本中EPAC1和EPAC2的蛋白水平变化。通过对大脑组织的石蜡切片进行免疫荧光染色,分析在神经元细胞中EPAC1和EPAC2蛋白水平变化情况。用免疫共沉淀的方法分析EPAC1磷酸化蛋白水平的变化。结果1.体内ICH模型实验结果:Western-blot检测结果显示,与sham组相比,在ICH组中EPAC2蛋白水平是明显增多的（P<0.01）,且在6小时达到高峰（P<0.01）。然而EPAC1蛋白在ICH后各个时间点蛋白水平没有明显变化。免疫荧光染色结果显示:在神经元细胞中,EPAC1和EPAC2均有表达;ICH后6h,神经元细胞内EPAC2蛋白表达量较sham组明显增加,而EPAC1蛋白表达较sham组无明显变化,与Western-blot结果是一致的。免疫共沉淀反应检测EPAC1的磷酸化蛋白水平变化情况:与sham组相比,ICH组中EPAC1的磷酸化蛋白水平明显下降（P<0.01）,并且在6小时达到最低谷（P<0.01）。2.体外ICH模型实验结果:与正常组相比,加入OxyHb后各个时间点中EPAC2蛋白水平均明显增多的（P<0.01）,且在6小时达到高峰（P<0.01）。而EPAC1蛋白水平没有变化。EPAC1的磷酸化程度变化结果显示:与正常组相比,在加入OxyHb后,EPAC1磷酸化蛋白水平明显下降（P<0.01）,并且在6小时达到最低谷（P<0.01）。结论1.EPAC1和EPAC2可能共同在大鼠脑出血后继发性脑损伤的病理过程中发挥作用。2.脑出血后6小时可能是下一步研究继发性脑损伤最合适的时间点。第二部分EPAC2对大鼠ICH后继发性脑损伤的影响及其可能存在的作用机制目的探讨EPAC2对大鼠ICH后继发性脑损伤的影响及其可能存在的作用机制。方法1.实验用动物分组:随机将108只成年健康SD大鼠（雄性）分配到6组中。分别为:Sham 组,ICH 组,ICH+Vehicle 组,ICH+ESI-05 低浓度组,ICH+ESI-05 中浓度组和ICH+ESI-05高浓度组。2.体内ICH模型的建立:通过立体定向仪将动脉血（抽取大鼠自体心脏动脉血）注入大鼠尾状核。假手术组中,仅用注射针穿刺脑组织形成穿刺隧道但不注血。3.体内模型给药方法:在ICH+ESI-05低浓度组中,建立ICH模型前2h以2 mg/kg体重的剂量进行大鼠腹腔内注射;在ICH+ESI-05中等浓度组中,建立ICH模型前2h以4 mg/kg体重的剂量进行大鼠腹腔内注射;在ICH+ESI-05高浓度组中,建立ICH模型前2h以8 mg/kg体重的剂量进行大鼠腹腔内注射;在ICH+Vehicle组中,建立ICH模型前2h大鼠腹腔内注射与干预组等量的溶剂。4.体外ICH模型的建立和分组:在神经元细胞中加入OxyHb（10μM）建立ICH体外模型。一共分为六组,分别是正常组、OxyHb组、OxyHb+Vehicle组,OxyHb+ESI-05低浓度组,OxyHb+ESI-05中等浓度组,OxyHb+ESI-05高浓度组,每个实验均进行6次独立重复。5.体外模型干预方法:OxyHb组:在神经元细胞中加入OxyHb（10μM）处理6小时后收集细胞;OxyHb+Vehicle组:在神经元细胞中加入Vehicle预处理1小时,然后加入OxyHb（10μM）处理6h后收集细胞;OxyHb+ESI-05低浓度组:在神经元细胞中加入ESI-05（2.5μM）预处理1小时,然后加入OxyHb（10μM）处理6h后收集细胞;OxyHb+ESI-05中等浓度组:在神经元细胞中加入ESI-05（5μM）预处理1h,然后加入OxyHb（10μM）处理6h后收集细胞;OxyHb+ESI-05高浓度组:在神经元细胞中加入ESI-05（10μM）预处理1h,然后加入OxyHb（10μM）处理6h后收集细胞。6.体内实验检测指标:采用RAPGEF4酶联免疫吸附测定试剂盒测定EPAC2蛋白酶活性。采用western-blot法检测脑组织中BIM,P38,Caspase3蛋白水平的变化。采用TUNEL荧光染色检测脑组织中凋亡的神经元细胞。采用FLUORO-JADEB荧光染色检测脑皮层细胞坏死情况。7.体外实验检测指标:采用RAPGEF4酶联免疫吸附测定试剂盒测定EPAC2蛋白酶活性。采用western-blot法检测神经元细胞中BIM,P38,Caspase3蛋白水平的变化。用流式细胞仪检测神经元细胞的凋亡情况。结果1.在体内,与sham组相比:ICH组中,实验大鼠的神经行为学损害加重（P<0.01）;TUNEL 阳性的神经元细胞明显增多（P<0.01）;FJB 阳性细胞明显增多（P<0.01）;脑组织中BIM,P38,Caspase3蛋白水平明显增多（P<0.01）。2.在体内,用ESI-05进行干预后,与Vehicle组相比,ESI-05低浓度组中BIM,P38,Caspase3蛋白水平无明显变化,ESI-05中等浓度组中BIM,P38,Caspase3蛋白水平明显下降（p<0.05）,同时与ESI-05中浓度组相比,ESI-05高浓度组中BIM,P38,Caspase3蛋白水平明显下降（p<0.05）。与Vehicle组相比,ESI-05中等浓度组大鼠的神经行为学损害明显减轻（P<0.01）,TUNEL 阳性的神经元细胞数明显减少（P<0.01）;FJB 阳性细胞数明显减少（P<0.01）。3.在体外,与正常组相比,在原代神经元细胞中加入OxyHb处理6小时后,BIM,P38,Caspase3蛋白水平明显增多（P<0.05）;凋亡细胞数明显增多（P<0.05）。4.在体外,用ESI-05预处理神经元细胞进行干预后,与Vehicle组相比,ESI-05低浓度组中BIM,P38,Caspase3蛋白水平无明显变化,ESI-05中等浓度组中BIM,P38,Caspase3蛋白水平明显下降（p<0.05）,同时与ESI-05中浓度组相比,ESI-05高浓度组中BIM,P38,Caspase3蛋白水平明显下降（p<0.05）。与Vehicle组相比,ESI-05中等浓度组中神经元凋亡细胞数明显减少（P<0.05）。结论EPAC2抑制剂ESI-05对ICH后继发性脑损伤有保护作用,其作用机制可能是通过抑制p38/BIM/caspase-3通路减少神经元细胞的凋亡。第三部分EPAC1蛋白在体外ICH模型中对神经元细胞的影响及其可能存在的作用机制目的探讨EPAC1蛋白在体外ICH模型中对神经元细胞的影响及其可能存在的作用机制方法1.体外ICH模型的建立及分组:在神经元细胞中加入OxyHb（10μM）建立体外ICH模型。一共分为六组,分别是正常组、OxyHb组、OxyHb+GFP组,OxyHb+WT组,OxyHb+S108E组,OxyHb+S108A组,每个实验均进行6次独立重复。2.检测外源性EPAC1蛋白磷酸化水平的实验分组方法:一共分为四组,分别是GFP组:用pEGFP-N2空载质粒转染神经元细胞,孵育48小时后收集细胞;WT组:用EPAC1（WT）-pEGFP-N2过表达质粒转染神经元细胞,孵育48小时后收集细胞;OxyHb+GFP组:用pEGFP-N2空载质粒转染神经元细胞,孵育48小时,然后添加OxyHb（10μM）孵育 6 小时后收集细胞;OxyHb+WT 组:用 EPAC1（WT）-pEGFP-N2过表达质粒转染神经元细胞,孵育48小时,然后添加OxyHb（10μM）孵育6小时后收集细胞。3.干预实验分组方法:一共分为六组,分别是正常组;OxyHb组:在神经元细胞中加入OxyHb（10μM）孵育6小时;OxyHb+GFP组:在神经元细胞中加入pEGFP-N2空载质粒预孵育48小时,然后添加OxyHb（10μM）孵育6小时;OxyHb+WT组:在神经元细胞中加入EPAC1（WT）-pEGFP-N2质粒孵育48小时,然后添加OxyHb（10μM）孵育6小时;OxyHb+S108E组:在神经元细胞中加入EPAC1（S108E）-pEGFP-N2质粒孵育48小时,然后添加OxyHb（10μM）孵育6小时;OxyHb+S108A组:在神经元细胞中加入EPAC1（S108A）-pEGFP-N2质粒孵育48小时,然后添加OxyHb（10μM）孵育6小时。4.检测指标:用免疫共沉淀法分析三种外源性GFP-EPAC1-WT,GFP-EPAC1-S108E,GFP-EPAC1-S108A蛋白的磷酸化水平;用荧光显微镜观察神经元细胞中GFP荧光的分布情况;用western bolt方法检测神经元细胞中BIM,P38,Caspase3蛋白水平的变化。结果1.在体外模型中,外源性GFP-EPAC1-WT磷酸化蛋白水平的变化情况:在神经元细胞内,外源性GFP-EPAC1-WT蛋白在108位丝氨酸（Ser）位点上能被磷酸化,并且在加入OxyHb孵育6小时后,磷酸化蛋白水平明显下降（P<0.01）。2.EPAC1-S108E点突变蛋白、EPAC1-S108A点突变蛋白与EPAC1野生型蛋白磷酸化程度的比较结果:与OxyHb+WT组相比,OxyHb+S108E组磷酸化水平较高（P<0.01）;相反,与OxyHb+WT组相比,OxyHb+S108A组磷酸化水平较低（P<0.01）。3.激光共聚焦荧光显微镜观察GFP荧光蛋白在神经元细胞中的分布情况:在S108A转染组中,神经元细胞膜周边绿色荧光聚集最明显;WT转染组中,神经元细胞膜周边有绿色荧光聚集;在S108E转染组中,未见到有明显的绿色荧光膜聚集效应。4.三种不同质粒转染的神经元细胞中BIM,P38,Caspase3蛋白水平比较:与正常对照组相比,OxyHb组中BIM,P38,Caspase3蛋白水平明显增多（P<0.01）。与OxyHb+WT组相比,OxyHb+S108E组中BIM,P38,Caspase3蛋白水平明显下降（P<0.01）;相反,与 OxyHb+WT 组相比,OxyHb+S108A 组中 BIM,P38,Caspase3 蛋白水平明显升高（P<0.01）。结论1.在体外ICH模型中,EPAC1通过磷酸化水平的变化,对神经元细胞的凋亡进行调控。EPAC1-Ser108位点的磷酸化状态,抑制了 EPAC1蛋白向细胞膜进行转位,起到抗凋亡的作用;反之,EPAC1-Ser108位点的去磷酸化状态,有利于EPAC1蛋白向细胞膜的转位,起到促凋亡的作用。2.EPAC1-Ser108磷酸化位点可能是治疗ICH的一个新的靶点。