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核糖核苷酸还原酶（RNR）是生物界唯一能催化4种核糖核苷酸（NDPs或NTPs,N=A,G,C或U）还原生成相应脱氧核糖核苷酸（d NDPs或d NTPs,N=A,G,C或U）的酶,广泛存在于各物种中。RNR为DNA的正常合成和损伤修复提供原材料,与细胞增殖密切相关,因此RNR可作为抗肿瘤、抗细菌和抗病毒等的靶点之一。我们仍对RNR酶催化机制、构象变化、全酶结构等了解得不够彻底,临床上使用的RNR抑制剂如羟基脲和吉西他滨存在靶向性差、毒性大、易产生耐药等缺陷。为了进一步阐明核糖核苷酸还原酶的催化机制,为设计新型高效低毒的小分子抑制剂提供思路,因此本文主要围绕Ⅰa类RNR大小亚基相互作用界面氨基酸残基的功能和RNR大亚基靶向的抗肿瘤小分子抑制剂进行研究。围绕RNR大小亚基相互作用界面的氨基酸残基,我们的研究内容如下:1)首先我们基于大肠杆菌RNR有活性的α2β2全酶结构模型分析大小亚基界面可能介导亚基相互作用和信息传递的氨基酸残基,发现可能存在E52-R329/R323和E350-R639/R735两组氨基酸残基介导亚基相互作用,通过比对多个物种的蛋白序列发现RNR大亚基R329以及小亚基E52和E350是非常保守的残基。2)通过突变体活性检测、大小亚基结合常数测定和N3CDP实验发现E52、R329和R639的突变体几乎完全丧失酶活性,与对应亚基结合能力减弱（E52Q除外）,证明了大肠杆菌RNR小亚基E52以及大亚基R329和R639是酶活性必需的氨基酸残基且介导亚基相互作用。3)我们将E52Q放在可部分克服conformational gating的F3Y122·-β2背景下进行研究,通过EPR实验和酶活性检测发现E52Q/F3Y122·-β2与WT-α2反应可生成自由基中间体Y356·和N·以及还原产物dCDP,表明E52Q/F3Y122·-β2通过克服conformational gating挽救E52Q-β2酶活性,证明E52参与conformational gating。4)通过大小亚基结合常数测定、Pull-down实验、分子筛和负染电镜,我们发现E52Q/F3Y122·-β2与WT-α2在反应过程中有很强的相互作用,可形成稳定但不对称的α2β2复合物。5)我们借助F3Y122·-β2研究R329和R639的作用机制,发现F3Y122·-β2挽救了R329A-α2、R329Q-α2和R639Q-α2的酶活性,提高了R329K-α2的酶活性,表明大亚基R329和R639也参与conformational gating。6)我们利用定点突变构建人RNR大小亚基对应的突变体,通过酶活性检测发现人RNR小亚基E106和E363及大亚基R324的突变体酶活性极低或丧失,表明这三个残基同时也是人RNR酶活性必需的。围绕RNR大亚基靶向的抗肿瘤小分子抑制剂,我们的研究内容如下:1)建立并优化了一套基于PCR测定人RNR多种底物酶活性的方法,测定结果与HPLC测定dCDP的结果基本吻合,可用于多种类型RNR抑制剂的高通量筛选。2)我们以人RRM1活性中心作为结合配体的对接口袋,通过多种分子对接技术对荷兰SPECS数据库进行了三轮虚拟筛选,获得287个靶向RRM1活性中心的候选小分子化合物。3)我们通过检测化合物对重组RNR三种底物酶活性的影响,筛选得到9个对RNR抑制作用强于羟基脲的化合物（RM23、RM26、RM27、RM41、RN15、RN27、RN41、RN78和RN81）,其结构特征具有多样性;通过检测这9个化合物对多种肿瘤细胞增殖能力的影响,发现RN27和RN81可抑制多种肿瘤细胞的增殖,抗肿瘤谱广,其中RN81的IC50多在5-10μM。4)我们选择RN81为苗头化合物,从SPECS数据库和Chemdiv数据库搜索得到19个结构类似物,通过体外重组RNR酶活性测定和肿瘤细胞增殖能力测定发现RN8106、RN8107、RN8112、RN8113和RN8116等可抑制RNR酶活性和多种肿瘤细胞增殖,活性与RN81相当或更强。5)RN81及其三个结构类似物RN8106、RN8107、RN8113与RRM1活性中心呈现较好的对接形态,且均能使RRM1的荧光发生淬灭,淬灭强度具有浓度依赖性,证明这四个化合物与RRM1有相互作用。6)在平板克隆形成实验中,RN81、RN8106、RN8107、RN8113处理三株胰腺癌细胞后使克隆形成数减少,再次表明这四个化合物能抑制胰腺癌细胞的增殖;d Ns的补充能增加克隆形成数,部分减弱这四个化合物对胰腺癌细胞的增殖抑制作用,间接表明这四个化合物通过影响DNA合成抑制肿瘤细胞的增殖;分别用流式技术、Ed U、WB检测RN81、RN8106、RN8107、RN8113处理胰腺癌细胞株24 h后对细胞周期分布、DNA合成、靶蛋白水平等的影响,结果表明这四个化合物都会导致三株胰腺癌细胞发生S期阻滞,DNA合成减少,但不影响RRM1的蛋白水平。综上所述,我们一方面对RNR亚基界面氨基酸进行探究,发现了小亚基E52和大亚基R329、R639均对RNR酶活性至关重要,证明了其机制为参与大小亚基相互作用和conformational gating,同时验证了在人RNR中E363、E106和R324等对应残基也对维持RNR酶活性必不可少,丰富了我们对RNR酶催化过程的认识。由E52Q/F3Y122·-β2与WT-α2形成的高比例且稳定的α2β2复合物为后续获得高分辨率的有活性的全酶结构提供了可能。另一方面,我们通过筛选和验证多个小分子化合物,获得了RN81、RN8106、RN8107和RN8113等多个抗肿瘤谱广的非核苷类RRM1小分子抑制剂,证明了这四个化合物在细胞内通过抑制DNA合成来抑制胰腺癌细胞的增殖。非核苷类RRM1抑制剂的研究为RNR抑制剂的研究和开发提供了一种新的策略。