背景癌细胞通常由正常体细胞转化而来,辐射、化学药物、激素、病毒感染和遗传等因素导致的原癌基因和抑癌基因的突变,对正常体细胞向癌细胞的转化密不可分。这一类转化使细胞失去了一些原有的生物学特性,从而只保留原细胞的一部分功能。抑癌基因能够通过促进细胞凋亡,抑制细胞转移从而防止细胞癌变和促进癌变中细胞的死亡。如果抑癌基因失活或者突变,那么正常细胞向癌细胞的分化就无法控制,从而最终导致肿瘤的发生。所以说,抑癌基因同时调控了癌症的发生和发展,这也契合了肿瘤形成的“两步法”。由于人类染色体是二倍体,所以抑癌基因在每对染色体上都有一个拷贝。因此,一个拷贝突变或受到转录抑制,另一个拷贝仍然可以正常转录并抑制细胞癌变。但是如果突变或转录抑制发生在一对等位基因上,细胞就会完全失去抑制细胞癌变的能力(5)。但也有例外,如抑癌基因p27,其单等位基因的突变或杂合子不足以使细胞恢复原有的状态,细胞的有丝分裂只有在双等位基因都未突变的情况下才能够被阻遏。PTEN(Phosphatase and tensin homolog)是细胞内十分重要的抑癌基因,定位于10号染色体,研究表明其正常表达能够抑制多种肿瘤的发生,但是在肿瘤中PTEN常常发生突变或表达缺失。在早期癌症诊断中,PTEN的缺失常常发生。通常来说,PTEN是一种双重蛋白脂类磷酸酶,由403个氨基酸残基组成,mRNA长度为5.5kb,其基因定位于10号染色体长臂23.3区段9号外显子。PTEN能够通过抑制PI3K/Akt通路抑制细胞增殖。但是在胚胎中,PTEN的突变则能引起多发性错构瘤综合症(hamartoma syndromes like Cowden Syndrome)、Bannayan-Riley-Ruvalcava syndrome综合症、PTEN related proteus syndrome PTEN相关性普罗特斯综合症和Proteus like syndrome普罗特斯样综合症。所有这些由PTEN缺失引起的综合症都能够增加肿瘤发生的风险。生长抑制因子Inhibitor of growth(ING)蛋白家族被认为是一类从酵母到人类都高度保守的抑癌基因家族。因此其生物学功能不言而喻,如调节染色质修饰、细胞增殖、血管生成和细胞迁移。目前已发现ING家族共有5个成员,从ING1-ING5,研究表明,在头颈胶质瘤、肝癌、胃癌、成釉母细胞瘤、星形胶质瘤、肺癌、乳腺癌和结肠癌等多种癌症中都伴随有ING4表达量的降低。目的:研究ING4、PTEN单基因对肝癌细胞增殖、凋亡和转移的影响;PTEN和ING4双基因共表达对肝癌的抑瘤增效效应与分子机制。方法:腺病毒包装在本科室已成功构建 pAdTrack-CMV-ING4-PolyA-promoter、pAdTrack-CMV-PTEN-PolyA-promoter 转移 质粒和pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN 重组转移载体的基础上,与 RGD-4C修饰的腺病毒骨架质粒pAD-RGD经同源重组、包装和扩增获得Ad-ING4、Ad-PTEN单基因表达重组腺病毒和Ad-ING4-PTEN双基因共表达重组腺病毒。1.Western blot 检测 Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN 体外感染肝癌SMMC-7721 和 HepG2 细胞中 GFP、PTEN 和 ING4 的表达。将腺病毒以50MOI的感染剂量感染SMMC-7721和HepG2细胞(细胞数约为4×106),实验分为5组:细胞对照组、Ad空载体组、Ad-ING4单基因组、Ad-PTEN单基因组和Ad-ING4-PTEN双基因组。感染48h后1000r/min离心5min收集细胞,PBS洗涤2～3次,按照107细胞/mL细胞裂解液的比例加细胞裂解液(含终浓度为1mMPMSF蛋白酶抑制剂)进行裂解,充分裂解后12000r/min离心5min,取总蛋白上清,并以4:1的比例与5×SDS蛋白上样缓冲液混匀,100℃煮沸5min,用分离胶为10%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳(浓缩胶100V,分离胶120V),并以200mA,2h将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上,然后将PVDF膜用5%脱脂奶粉37℃脱色摇床上封闭1h或4℃C封闭过夜;分别用小鼠抗人GFP抗体(1:1000)、小鼠抗人ING4(1:1000)和小鼠抗人PTEN抗体(1:1000)在4℃C孵育过夜,TBST洗涤3次,每次5min;再分别加HRP标记的二抗,37℃避光作用1h,TBST避光洗涤3次,每次5min;最后在化学发光仪上进行拍照。1.MTT法检测Ad-RGD-ING4和/或PTEN单、双基因表达对肝癌SMMC-7721和HepG2细胞生长的影响将对数生长期的SMMC-7721和HepG2细胞,按5×103个/孔接种于96孔板,37℃C,5%CO2培养24h后,空病毒阴性对照组和实验组分别加50MOI感染剂量的Ad、Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN 病毒液,细胞对照组加 DMEM,每组设5个复孔,37℃C、5%CO2条件下孵育。随后分别于1d、2d、3d、4d、5d加MTT(5mg/mL)1OμL/孔,继续孵育 4-6h 后加入溶解剂[10%SDS+1%HCl(1mol/L)]10OμL/孔,至次日待甲臢结晶完全溶解后,在酶联免疫检测仪上测OD570值,并按抑制率(%)=(对照组OD570值—实验组OD570值)/对照组OD570值计算细胞生长抑制率。2.Annexin-V-PE/7-AAD双染流式细胞仪检测Ad-ING4和/或PTEN单、双基因表达对SMMC-7721和HepG2细胞凋亡的影响采用PE-AnnexinV/7-AAD双荧光标记,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡的变化。具体方法如下:将腺病毒以50MOI感染剂量分别感染处于对数生长期的SMMC-7721和HepG2细胞,分为6组:细胞对照组NC、Ad空载体腺病毒组、Ad-ING4单基因重组腺病毒组、Ad-PTEN单基因重组腺病毒组、Ad-ING4-PTEN双基因重组腺病毒组。腺病毒感染细胞后37℃C 5%C02培养48h,收集细胞制成单细胞悬液,加入10OμL的1×Binding Buffer悬浮细胞后加入1μL Annexin V-PE混匀,37℃避光水浴15min,然后加入5μL7-AAD染液混匀,37℃避光水浴10min,然后加入400μL的1 ×Binding Buffer,1h内流式细胞仪检测。3.流式细胞仪检测Ad-ING4和/或PTEN单、双基因表达对SMMC-7721和HepG2细胞周期的影响将对数生长期的SMMC-7721和HepG2细胞,按5×103个/孔接种于96孔板,37℃C,5%C02培养24h后,空病毒阴性对照组和实验组分别加50MOI感染剂量的Ad、Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN病毒液,细胞对照组加DMEM,每组设5个复孔,37℃C、5%C02条件下孵育。用0.25%胰蛋白酶溶液消化收集细胞;制成单细胞悬液后移入1.5ml离心管中,2000r/min离心5min;用1×Buffer A洗涤细胞一次(2000r/min离心5min)收集并调整细胞浓度为1×106/ml;细胞加9倍体积的70%乙醇于-20℃固定至少12h;离心收集细胞后,用1×BufferA洗细胞以除去乙醇,细胞重悬于500μlBufferA中;加入终浓度 100g/ml的RNaseA1μl,37℃C,反应30min;加入5μl PI染液混匀,常温闭光染色30min;流式细胞仪检测细胞周期4.体外划痕实验检测Ad-ING4、Ad-PTEN和Ad-ING4-PTEN体外对肝癌细胞迁移能力的影响将SMMC-7721和HepG2细胞株于对数生长期接种于6孔板中培养。待细胞基本长满后将Ad、Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN腺病毒以20MOI的剂量分别感染SMMC-7721和HepG2细胞株,以未感染腺病毒的SMMC-7721和HepG2细胞作为空白对照。用无菌200μl枪头于细胞层中横向划线,形成宽度均匀一致的划痕,造成培养细胞伤口模型,此时倒置显微镜下观察拍照,测定宽度,作为划痕后0时。具体方法为:位于划痕缘间隔0.5 mm标定1个测量点,每条划痕取3个测量点。测量每一个点垂直于划痕方向的宽度,计算3点的均值作为实验的初始划痕宽度值,于12h、24h、36h、48h和72h测定划痕宽度。5.侵袭小室检测Ad-ING4、Ad-PTEN和Ad-ING4-PTEN体外对肝癌细胞侵袭能力的影响将冻存于—80℃C冰箱的BD matrigel4℃C过夜,变成液态;取300ul无血清培养基,加入60 μl Matrigel,冰浴混匀,加入上室各1OOul;放入37℃C培养箱中,孵育5h,直至出现“白色层”变为固态;将Ad、Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN腺病毒以50MOI的剂量分别感染SMMC-7721和HepG2细胞,以未感染腺病毒的SMMC-7721和HepG2为空白对照。24h后收集各组细胞用含BSA的无血清培养基重悬,调整细胞密度至5×105/ml;用无血清培养基洗Matrigel 1次;每孔加入1OOul细胞悬液;下腔室中加入500ul含有20%FBS条件培养基,37℃C培养箱中,孵育24h。取出transwell小室用PBS洗2遍,5%戊二醛固定,4℃C;用棉球擦去上表面细胞,加入0.1%结晶紫染色10min,室温0.5h,PBS洗2遍,显微镜下观察并拍照。6.Western blot 检测 Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN 体外感染肝癌细胞凋亡Bad、Bcl-2、Bax、Bcl-XL和周期调控相关基因p53、p21、CyclinD的表达将腺病毒以50MOI的感染剂量感染SMMC-7721和HepG2细胞(细胞数约为4×106),实验分为4组:细胞对照组、Ad-ING4单基因组、Ad-PTEN单基因组和Ad-ING4-PTEN双基因组。感染48h后1000r/min离心5min收集细胞,PBS洗涤2～3次,按照107细胞/mL细胞裂解液的比例加细胞裂解液(含终浓度为1mM PMSF蛋白酶抑制剂)进行裂解,充分裂解后12000r/min离心5min,取总蛋白上清,并以4:1的比例与5×SDS蛋白上样缓冲液混匀,100℃C煮沸5min,用分离胶为10%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳(浓缩胶100V,分离胶120V),并以200mA,2h将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上,然后将PVDF膜用5%脱脂奶粉37℃C脱色摇床上封闭1h或4℃C封闭过夜;分别用Bad抗体(1:2000)、Bcl-2 抗体(1:2000)、Bax 抗体(1:2000)Bcl-XL 抗体(1:1000)、p53 抗体(1:1000)、p21抗体(1:1000)和CyclinD抗体(1:1000)在4℃℃孵育过夜,TBST洗涤3次,每次5min;再分别加HRP标记的二抗,37℃避光作用1h,TBST避光洗涤3次,每次5min;最后在化学发光仪上进行拍照。结果:1.Western blot 检测 Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN 体外感染肝癌SMMC-7721 和 HepG2 细胞中 GFP、PTEN 和 ING4 的表达。Western blot结果如图1和2显示,病毒感染组Ad、Ad-PTEN、Ad-ING4、Ad-ING4-PTEN组都有GFP表达,表明各组病毒感染成功。Ad-ING4-PTEN双基因重组腺病毒感染可产生与抗人ING4抗体和抗人PTEN抗体特异性结合的条带;Ad-ING4单基因重组腺病毒感染组只产生与抗人ING4抗体特异性结合的条带;Ad-PTEN单基因重组腺病毒感染组只产生与抗人PTEN抗体特异性结合的条带;Ad空病毒感染组和NC对照组均未出现上述条带。Western blot鉴定结果进一步表明重组腺病毒介导的外源性ING4和/或PTEN基因在SMMC-7721和HepG2细胞中成功表达目的蛋白。2.MTT法检测Ad-RGD-ING4和/或PTEN单、双基因表达对肝癌SMMC-7721和HepG2细胞生长的影响MTT实验结果如图3所示,在SMMC-7721和HepG2细胞中Ad-ING4、Ad-PTEN单基因重组腺病毒和Ad-ING4-PTEN双基因重组腺病毒都能下调细胞增殖速率,但Ad-ING4-PTEN双基因组相较于单基因组增殖抑制效果更佳明显。3.Annexin-V-PE/7-AAD双染流式细胞仪检测Ad-ING4和/或PTEN单、双基因表达对SMMC-7721和HepG2细胞凋亡的影响Annexin-V-PE/7-AAD双染色标记后FCM检测细胞凋亡率结果如图4所示Ad-ING4、Ad-PTEN单基因重组腺病毒和Ad-ING4-PTEN双基因重组腺病毒均能诱导SMMC-7721和HepG2细胞凋亡,凋亡率分别为SMMC-7721细胞18.9%、17.6%和24.7%,HepG2细胞20.1%、18.9%和23.7%,与空载体腺病毒组和细胞对照组比较具有统计学意义(P<0.05);并且Ad-ING4-PTEN双基因重组腺病毒组诱导SMMC-7721和HepG2细胞凋亡的作用明显强于单基因腺病毒Ad-ING4组和Ad-PTEN组,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.流式细胞仪检测Ad-ING4和/或PTEN单、双基因表达对SMMC-7721和HepG2细胞周期的影响如图5和6所示,除Ad-ING4-PTEN双基因重组腺病毒组能够SMMC-7721细胞中诱导G2/M期阻滞外,Ad-ING4和Ad-PTEN单基因重组腺病毒不能诱导SMMC-7721细胞G2/M期阻滞。但在HepG2细胞中Ad-ING4、Ad-PTEN单基因重组腺病毒和Ad-ING4-PTEN双基因重组腺病毒均不能诱导细胞G2/M期阻滞。5.体外划痕实验检测Ad-ING4、Ad-PTEN和Ad-ING4-PTEN体外对肝癌细胞迁移能力的影响如图7和8所示,NC组、Ad空病毒组细胞随着时间的延长,划痕的宽度由于细胞的迁移而逐渐变窄,划痕由于细胞的迁移逐渐融合,Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN腺病毒感染组细胞迁移受到抑制,培养第五天时仍可见明显的划痕。Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN腺病毒双基因重组腺病毒均能抑制SMMC-7721和HepG2细胞的迁移,与Ad空载体腺病毒组和细胞对照组比较具有统计学意义(P<0.05);并且Ad-ING4-PTEN双基因重组腺病毒抑制细胞的迁移作用明显强于Ad-GFP组、Ad-ING4组和Ad-PTEN组,差异具有统计学意义(P<0.05)。6.侵袭小室检测Ad-ING4、Ad-PTEN和Ad-ING4-PTEN体外对肝癌细胞侵袭能力的影响如图9所示,Ad-ING4、Ad-PTEN和Ad-ING4-PTEN重组腺病毒感染后,SMMC-7721和HepG2细胞体外侵袭能力均有下降,穿膜细胞数与Ad空载体腺病毒组和细胞对照组比较均呈显著性差异(P<0.05);且Ad-ING4-PTEN双基因重组腺病毒抑制SMMC-7721和HepG2细胞侵袭的效应强于Ad-ING4、Ad-PTEN单基因重组腺病毒(P<0.05)。7.Western blot 检测 Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN 体外感染肝癌凋亡Bad、Bcl-2、Bax、Bcl-XL和周期调控相关基因p53、p21、CyclinD的表达如图 10 和 11 所示,在 SMMC-7721 和 HepG2 细胞中 Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN腺病毒感染组与NC组和Ad组相比BAD和BAX表达显著上调,Bcl-2与Bcl-XL表达显著降低,其中Ad-ING4-PTEN双基因组中BAX表达相较于单基因组显著上调。如图 12 所示,在 SMMC-7721 细胞中 Ad-ING4、Ad-PTEN、Ad-ING4-PTEN腺病毒感染组与NC组相比抑癌基因p53和p21显著上调,周期调控蛋白CycinD显著下调。结论ING4与PTEN同为抑癌基因,从不同的信号通路进行调控,抑制肿瘤生长、促进肿瘤凋亡。课题证明了 ING4与PTEN单基因能够显著抑制肝癌细胞增殖和迁移、促进癌细胞凋亡。相比较于单基因表达,ING4与PTEN的双基因表达更具显著抑制肝癌细胞体外迁移及侵袭的效应,抑制肝癌细胞增殖效果更佳显著,并且能够显著上调细胞凋亡和凋亡基因BAD和BAX下调抑凋亡基因Bcl-2与Bcl-XL的表达。虽然ING4与PTEN双基因未发现其对细胞周期有调控作用,但细胞周期调控因子CyclinD在双基因表达的作用下显著下调,周期阻遏因子p53和p21显著上调。因此ING4与PTEN双基因调控细胞周期的机制还需进一步研究。