背景与目的遗传病是临床遗传咨询门诊最常见的疾病之一,也是临床医生特别是基层医院的广大医务工作者所面对的最难解决的问题,这是因为,遗传病特别是散发性遗传病,千奇百怪,因遗传异质性、遗传机制以及环境作用等,是基因型到表型复杂化,而且对遗传病研究技术发展快速,再加上专用设备贵重,且需要专业技术人才等。遗传病患者到临床遗传咨询门诊的目的是：了解疾病的发病原因及危害；孕前咨询子代发病几率及如何避免胎儿发病或避免患儿出生等问题。对于避免疾病发生,目前一般采用植入前诊断(preimplantation genetic dianosis,PGD)。即在胚胎植入之前,利用现代先进的科学技术对其中一个卵裂球进行目的基因的检测,选择基因正常的胚胎植入子宫。对于避免患儿出生,目前是采用产前诊断(pmetal diagnosis,PD)。产前诊断技术即在胎儿出生前采集绒毛组织或羊水或脐带血,采用细胞遗传学和分子生物学技术进行检测,排除异常胎儿,进行选择性生育。进行PGD和PD的前提均需要首先确定致病基因。然而,确定致病基因存在很多不确定因素,对于绝大多数基层医院来说更不是一件容易的事情。因此,筛选和确定致病基因已成为临床和基础研究的重要内容。在过去攻读博士学位的4年内,我们先后进行了5个遗传病家系的研究：2个II型牙本质发育不良家系,1个神经系统异常综合征家系,1个显性营养不良性胫前型大疱性表皮松懈症家系和1个复杂性颅面畸形家系。本文仅对显性营养不良性胫前型大疱性表皮松懈症家系和复杂性颅面畸形家系进行总结,包括研究材料、方法、结果和结论。材料与方法1.家系1：显性营养不良性胫前型大疱性表皮松懈症(Pretibial epidermolysis bullosa, PEB)家系1.2材料：该家系来自中国南方,4代共有7个患者在世,先证者是一个女性,第一次就诊是23岁,在她12岁时双下肢胫前区域出现剧烈的瘙痒,用手反复抓挠后出现红色丘疹并逐渐播散开至整个双下肢。检查发现,在双下肢区域布满痒疹样粟丘疹,皮肤黏膜出现大疱,破裂愈合后可留下萎缩性瘢痕、脱皮,干燥时瘙痒加重,患者其他部位的皮肤未见受累,双脚趾甲呈萎缩性或发育不良,手指甲正常。先证者26岁时右下肢症状消失,左下肢症状也相对减轻。家系调查发现,其他受累成员基本症状相似,但病情严重程度区别较大,其中先证者母亲和大姨症状较重,可见严重的大疱、糜烂,腹部和前臂均有不同程度的丘疹,双趾甲和指甲发育不良。先证者三姨、弟弟和姨表妹症状为中等程度,而先证者(由重减轻)和姨表娣则症状较轻。1.2方法：签订知情同意书后,绘制家系图谱,进行家系问卷调查。采集家系中所有受累成员和部分未受累成员静脉血,所有受累成员首先进行、血液常规、肝肾功能、自身抗体、抗核抗体、抗双链DNA抗体以及免疫球蛋白等检测。所有经脉血均以EDTA抗凝,及时抽提淋巴细胞DNA并定量分析,分装后于-80℃保存。因目前研究显示,DDEB的致病基因是COL7A1,我们首先在该基因附件选择4个微卫星标记(D3S1581、D3S2456、D3S3560和D3S3604)进行共分离分析,以初步判断该家系是否与COL7A1基因相关,确定相关后,首先对先证者进行外显子测序筛选突变位点,并检测所有家系中受累成员和部分健康成员进行共分离,最后,选用200个无关个体采用变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)验证以确定候选基因为该家系中致病基因。2.家系2：复杂性颅面畸形(The acrofacial dysostoses,ADs)2.1材料：胎儿出生后呈多发畸形：患儿拱形眉毛,睑裂下斜、狭小,眼距宽,上睑下垂,下眼睑下陷呈三角形,双侧外耳畸形,外耳道闭锁,鼻凸起畸形,发际低,巨口,颧骨和颚发育不良,小颌畸形,整个面形呈倒三角形,两上肢呈曲线型,肘关节向外,爪状手,贯通掌纹,畸形足,外阴异常,无肢体缺陷,拒绝尸体解剖。出生体重1800g(<3rd),身长45cm (<3rd), APGAR评分：1min时7分,5min时2分。呼气机支持呼吸,由于严重呼吸困难,于出生后6小时死亡。患儿母亲兰XX,26岁,中国湖南省岭水江县人,汉族人,身高156cm,表型和智力正常。14岁月经初潮,周期30天,经期4-5天,量中等,无痛经,无血块等。患儿父亲30岁,智力和表型无特殊异常,无不良嗜好,夫妻非近亲婚姻。婚后曾妊娠4次,人工流产1次,自然流产2次,本次宫内妊娠35w+4,羊水过多(约4000ml),血压126/77mmHg,宫底耻联上34cm,先露头,已固定,胎位LOA,胎心140/次/分。肛查宫开154+cm,胎儿在预产期前12天出生,平产,产程顺利。2.2方法：签订知情同意书后,首先对家族史、妊娠史和病史等基本情况进行调查,收集静脉血采用全自动分析仪做生物化学、免疫学和血液细胞学等常规检查进行病因学排查,采用微量淋巴细胞体外培养做细胞核型分析以排除遗传染色体畸变,再采用荧光原位杂交技术进行TUPLE1基因(90%先天心脏病患者具有该基因的缺失)、ARSA基因(85%颚心面综合症患者具有该基因的缺失)和DAZ基因(Y染色体末端微缺失)。然后采用比较基因组杂交技术进行基因拷贝数变化分析,发现阳性区域后再在PubMed上查阅并初步确定候选基因,最后采用RT-PCR对候选基因进行验证。结果与讨论1.PEB家系：常规检测均未见异常。单倍型分析发现,所有受累成员均遗传了父亲的致病单倍型,采用Sanger测序发现,在COL7A1基因的第73个外显子的6101位置发现一个突变,即c.6101G>T,该突变为错义突变,使甘氨酸转变为颉氨酸(G2034V)。该突变在所有受累家系成员均可发现,而未受累成员则未发现,200个无关个体的DHPLC验证结果均为阴性。因此,可以判定该突变为该家系疾病的致病基因。家系中受累成员临床症状严重程度差异,可能与基因内修饰、内含子突变以及外环境有一定关系。2.颅面畸形：临床常规检测未见异常,染色体数目和结构无异常,TUPLE1、ARSA和DAZ基因无缺失,比较基因组杂交分析发现在1号染色体上有两处具有拷贝数增多。其中一处位于1p36.33(784258bp～1556626bp之间),长度约为722kb。此异常在父母的样本中没有发现。该片段含有51个基因,12个为已知基因,5个是macro-RNA,经过文献查询,其中的VMA1基因编码细胞外基质蛋白超家族中血管性血友病因子A蛋白,对软骨结构和功能起着重要作用。另一处基因组拷贝数变化位于1q21.3-22(153182506bp-153318761bp之间),长度为136kb,含有12个基因,其中9个为已知基因,其中的PYGO2基因可通过调节Wnt信号通路在颅面骨发育中起着重要作用。通过RT-PCR进行验证,结果显示参照基因GAPDH的拷贝数(2-△△Ct)均是1,而VWA1和PYGO基因的2-△△ct分别为1.65和2.01,说明均存在重复。从而证明array-CGH结果是准确的。结论1.PEB家系：在COL7A1基因中我们发现了一个新的突变(c.6101G>T),该突变为错意突变,使甘氨酸转变为结氨酸(G2034V)。从而补充了COL7A1基因突变数据库,有利于该家系的遗传咨询,为进行PGD和PD提供了分子生物学诊断依据。同时,我们认为,c.6101G>T可做为鉴别诊断PEB,有利于DDEB的分类,另外,该家系受累成员表型的差异也可能与该突变有关。2.Ads：本例颅面畸形家系中,我们在1号染色体上发现2个CNV,分别位于1p36.33和1q21.3-22,分别含有51和12个基因,其中VWA1与PYG02基因可能是该家系的候选致病基因。但不能排除2个CNV中其他基因对患儿的影响,又因这些异常在其父母双亲基因组未发现,患儿的表型与文献报道的颅面发育不良综合征也有明显区别,所以,患儿可能是颅面畸形综合征的一种新的类型。