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主要组织相容性复合体(the major histocompatibility complex,MHC)在机体的免疫反应中具有抗原加工和提呈的作用,MHC Ⅱ类分子的伴侣蛋白恒定链(invariant chain,Ii)对MHC Ⅱ类分子的成熟、装配和正确折叠等具有重要作用。不同物种的Ii结构相似,同源性在86%以上,主要有4个结构域组成,分别为跨膜区(Cyt)、胞浆区(Tra)、CLIP 区(class Ⅱ-associated invariant chain peptide,CLIP)和三聚体区(Trim)。研究发现以Ii为载体的疫苗可以刺激机体产生较高的抗体水平,本研究主要探明鸡Ii与不同物种MHC分子的结合特性、协助细胞内抗原转运及其细胞途径。首先,确定了鸡Ii片段跨种结合MHC分子的特性。根据GenBank已经登录的小鼠(mouse)、鸡(chicken)、草鱼(grass carp)的Ii、Mhc Iα、Mhc Ⅱβ的基因序列设计引物,通过PCR扩增获得全长目的基因片段,然后分别将其克隆到真核表达载体pEGFP/pmCherry-C1/N1中,构建真核重组质粒,转染293T细胞,应用激光共聚焦显微镜观察Ii与MHC分子在细胞内共定位。结果表明在转染细胞内,小鼠、鸡、草鱼Ii与MHC Iα、MHC Ⅱβ分子具有跨种交叉共定位的特点。同时,将小鼠Ii(mIi)、鸡Ii(cIi)和草鱼Ii(gIi)分别插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达质粒 pGEX-4T-1-mIi、pGEX-4T-1-cIi和 pGEX-4T-1-gIi。依据不同物种的Mhc Ⅱβ基因结构,克隆并将其β1(抗原肽结合域基因)插入原核表达载体pET-32a,构建原核重组质粒pET-32a-mβ1、pET-32a-cβ1和pET-32a-gβ1。将质粒转化进大肠杆菌Rosetta(DE3)中,构建相应重组菌,并进行诱导表达,其蛋白产物分别经镍离子层析柱纯化,并应用Pull-down技术检测关联蛋白分子间关系。结果发现小鼠、鸡、草鱼的Ii具有跨种交叉结合其他不同物种的MHC Ⅱβ1分子。其次,探明了鸡Ii的胞浆区/跨膜区(Ii(Cyt/Tra))具有在细胞内协助抗原肽转运的功能。本研究构建4个目的基因片段(Ii、Ii(Cyt/Tra)、F2(新城疫病毒F蛋白片段)和Ii(Cyt/Tra)/F2),分别将它们插入原体表达载体PET-32a和真核表达载体pmCherry-C1/N1中,构建8个重组原核和真核质粒。将4个重组原核质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导表达后,应用Pull-down检测目的蛋白与MHCⅡβ分子的结合。4个重组的真核重组质粒转染真核细胞293T,应用激光共聚焦确定它们在真核细胞与MHC Ⅱβ的共定位以及在内吞体的定位。结果表明,构建的重组质粒均能在原核和真核表达相应目的蛋白;Ii、Ii(Cyt/Tra)和Ii(Cyt/Tra)/F2不仅能够与MHCⅡβ结合,还能进入细胞内吞体,而对照F2既不能与MHC Ⅱβ结合也不能进入内吞体。说明Ii活性片段Cyt/Tra不仅本身具有结合MHC Ⅱβ的作用,而且还可以携带抗原肽与之结合并一起转入细胞内吞体而进入抗原递呈途径。最后,探明了 Ii功能区域引起免疫应答的信号通路的影响。将构建的真核质粒pmCherry-C1-cCyt/Tra转染鸡巨噬细胞HD-11,24h后抽提细胞RNA并进行反转录,应用实时荧光定量PCR对相关膜受体(TLR4,NLRC5和NLRP3)、部分抗原提呈分子(Ii和MHC Ⅱβ)、信号通路分子(STAT3和NF-κB)和细胞因子(IL-6、TNF-α、IL-1进行定量检测。结果表明鸡Ii功能片段Ii-Cyt/Tra可以上调NF-κB的转录水平,同时也上调Ii、MHC Ⅱβ、NLRP3、IL-6、TNF-α、IL-1β的转录水平,而下调STAT3的转录水平。由于NF-κB是重要的调节因子,所以推测Ii功能域可能通过调节NF-κB信号通路途径促进抗体提呈分子及其细胞因子的转录,最终提高细胞的免疫水平。这些实验结果提供了以Ii及其功能片段为载体而提高免疫效果的实验支撑,也为进一步探索以Ii为载体疫苗的免疫增强作用的机理奠定了基础。