“痰壅胞宫”的生物学基础及其效应-2基于db/db小鼠卵巢功能障碍的研究

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目的:祖国医学认为痰湿型不孕症的病因病机为“痰壅胞宫”,即痰浊壅塞胞宫,现代医学认为痰浊的生物学基础是糖脂代谢的异常,db/db小鼠具有糖脂代谢异常,生殖功能障碍等特点,符合“痰壅胞宫”不孕症的症候特征,因此我们选择db/db小鼠进行基础实验研究,探索引起痰浊患者生殖功能障碍的原因,证明“痰壅胞宫”理论的正确性,同时明确卵巢内瘦素信号系统的传导途径和卵巢局部瘦素信号缺失对卵巢自身功能的影响。方法:①雌性B6.Cg-m+/+Leprdb小鼠和其同窝出生的雌性野生型C57BL/6J小鼠以1:2的比例购买于南京大学模式动物中心,单笼饲养,控制饲养环境。于出生后12周体成熟时期对瘦素长受体缺失(LR—)的雌性B6.Cg-m+/+Leprdb小鼠和其同窝出生的有完整LR的雌性野生型C57BL/6J小鼠(LR+),进行卵巢交互移植,构建实验小鼠的LR基因型组合分别为A(躯体LR+,卵巢LR—)、B(躯体LR+,卵巢LR—)、C(躯体LR+,卵巢LR+)、D(躯体LR—,卵巢LR+)、E(躯体LR—,卵巢LR—)共5组(n=5)。②每日给予B组小鼠腹腔注射盐酸小檗碱,连续两周,检测各自卵巢的周期变化。③瘦素(1μg/g)刺激试验后取材,检测全身糖脂代谢指标和生殖激素、HE染色法检测卵巢内脂质化情况及卵巢组织形态功能的变化,免疫组化法检测卵巢内瘦素传导信号蛋白包括瘦素(ob)、瘦素长受体(ob-Rb)、Janus激酶(JAK2)、信号传导和转录活化因子3(stat3)、磷酸化的stat3(p-stat3)、活化的STAT3蛋白抑制剂(PIAS3)、细胞因子转导信号抑制物3(socs3)的表达;RT-PCR法检测瘦素长受体(ob-Rb)和socs3 mRNA的表达。结果:1、D、E组与A、B、C三组比较,其体重增加约1倍(P<0.01),性腺周围脂肪垫重量增加约10倍(P<0.01);血葡萄糖、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和胰岛素水平增加2-3倍(P<0.01);A、B、C三组的全身血糖脂指标相似,D和E两组的高糖脂血症升高程度也相似。2.阴道细胞涂片发现A、B、C三组小鼠均出现正常的动情周期,而D、E两组则始终处于动情间期,小鼠16周龄时D、E组与A、B、C三组比较:卵巢重量及E2、P、FSH、LH水平显著下降(P<0.05),HE染色可见A、B、C三组小鼠的卵巢组织形态正常,内可见黄体及发育中的卵泡,而D、E两组小鼠的卵巢形态显著萎缩变小,其内可见因脂质化改变而形成的脂肪细胞空泡。3瘦素刺激后免疫组化检测瘦素在A、B、E组的卵巢中呈阳强性表达,在C、D组卵巢中呈阳性表达:瘦素长受体在A、B、E组的卵巢中表达均呈阴性,而C、D组卵巢内呈阳性表达;JAK2在A、B和E组卵巢内均呈阴性表达,在C组卵巢内呈强阳性表达,在D组卵巢内呈弱阳性表达;stat3在A、B、C、D、E五组的卵巢中均呈阳性表达;磷酸化的stat3(p-stat3)在A、B、E组的卵巢中阴性表达,C组及D组的卵巢中阳性表达;活化的STAT3蛋白抑制剂(PIAS3)在A、B、C、D、E五组卵巢中均呈阳性表达;细胞因子转导信号抑制物3(socs3)在A、B、D、E组卵巢中呈阳性表达,在C组卵巢中呈强阳性表达。4、RT-PCR结果显示瘦素长受体在A、B、E组均呈阴性表达,在C、D组则均呈阳性表达,且C组的表达量高于D组;SOCS3在A、B、C、D及E组均呈阳性表达,且C组的表达量高于其他四组。结论:1、卵巢内存在完整的瘦素信号传导系统,但是卵巢局部瘦素信号传导缺失并不影响卵巢自身的生殖及内分泌功能;2、db小鼠卵巢功能障碍主要是高糖脂血症累及生殖器官导致其脂质化引起;3、由此可见,“痰壅胞宫”可以引起临床痰湿型不孕症患者生殖功能障碍这一理论是正确的,而糖脂代谢异常是“痰壅胞宫”的生物学基础。
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