研究背景:卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一,其发病率在我国位居第三位仅次于宫颈癌和宫体癌,严重影响人类健康。近年来,ADP核糖聚合酶(Poly ADP-ribose Polymerase,PARP)抑制剂在卵巢癌的治疗中取得显著成效,开启了小分子抑制剂靶向治疗卵巢癌的大门。目前,PARP抑制剂主要被批准用于BRCA(Breast cancer)突变的卵巢癌患者。然而,随着临床试验数据的累积,研究者发现不论患者是否存在BRCA突变,使用PARP抑制剂Niraparib Rucaparib治疗的卵巢癌患者均能获益,显著改善了患者的无疾病生存期。因此,如何从PARP1(Poly ADP-ribose Polymerase 1)的生物学功能出发理解临床上这一现象成为该领域的研究热点。随着PARP1研究的深入关于它的其他生物学功能也开始受到关注。近年来的研究发现PARP1可以通过激活转录因子、抑制转录因子活性的方式或直接作为转录因子调控基因表达,从而调控肿瘤细胞的多种生物学功能。本研究通过分析TCGA数据库(The cancer genome atlas)发现PARP1 m RNA高度表达与卵巢癌、乳头状肾细胞癌、ER~+(Estrogen receptor-positive)乳腺癌以子宫体癌患者的无疾病生存期(Progress free survival,PFS)呈显著负相关,并将这四种肿瘤中与无疾病生存期相关的基因进行重合分析,发现91个基因的表达与PARP1 m RNA的高度表达呈负相关。同时,在卵巢癌细胞上分别敲除PARP1、过表达PARP1和给予PARP抑制剂Olaparib,采用全基因组芯片检测基因变化,发现13个基因与PARP1的高度表达呈显著负相关。进而将从TCGA数据分析获得的91个基因与芯片分析获得的13个基因进行重合对比分析,发现PARP1蛋白表达与金属硫蛋白-1M(Metallothionein 1M,MT1M)基因转录呈显著负相关,这提示MT1M可能是PARP1调控的靶基因。那么,PARP1是否通过负性调控MT1M,从而调控卵巢癌的哪些生物学行为?金属硫蛋白-1M(MT1M)是半胱氨酸富集的小分子蛋白,属于金属硫蛋白(MT-1)家族成员,特异性结合金属离子,在金属解毒氧化应激保护方面发挥重要作用。近年来研究表明MT1M能够显著抑制多种肿瘤的增殖与转移,如肝细胞癌、甲状腺乳头状癌,是潜在的抑癌基因。考虑到MT1M在肿瘤细胞中抑制肿瘤细胞增殖与转移的作用,本研究推断PARP1可能通过负性调控MT1M参与肿瘤细胞的增殖与转移。本研究将围绕PARP1负性调控MT1M表达这一生物学现象,考察PARP1负性调控MT1M在卵巢癌增殖与转移中的作用具体的分子机制:(1)分析TCGA数据库中PARP1 m RNA的高度表达与多种肿瘤无疾病进展期的相关性,结合卵巢癌细胞基因芯片的数据,发现PARP1负性调控卵巢癌细胞中MT1M的表达;(2)明确MT1M的表达对卵巢癌细胞增殖与迁移的影响,并寻找PARP1调控MT1M表达的具体分子机制;(3)MT1M的表达在PARP抑制剂抗卵巢癌转移的作用。本研究发现了PARP1新的靶基因MT1M以调控卵巢癌转移的新机制即PARP1通过抑制MT1M表达促进卵巢癌转移,并为PARP抑制剂在卵巢癌治疗中的应用提供新的理论依据。第一部分PARP1抑制MT1M转录促进卵巢癌转移的作用研究研究方法:(1)采用TCGA数据库分析在PARP1 m RNA表达与与卵巢癌、乳头状肾细胞癌、ER~+乳腺癌、子宫体癌、膀胱癌、睾丸生殖细胞肿瘤、头颈鳞状细胞癌、以胰腺导管腺癌患者的无疾病生存期的相关性;(2)进一步采用Kmplot数据库分析,找到与PARP1 m RNA表达呈负相关性的基因;(3)在非BRCA突变的卵巢细胞OVCAR8上分别敲除PARP1、过表达PARP1和给予PARP抑制剂Olaparib,采用全基因芯片检测基因变化,寻找与PARP1表达呈负相关的基因;(4)将TCGA数据库分析出与PARP1表达呈负相关的基因,与卵巢癌细胞OVCAR8中与PARP1表达呈负相关的基因进行重合对比分析,发现了PARP1调控新的靶基因MT1M;(5)在非BRCA突变的卵巢癌SKOV3、Ca OV3和OVCAR8,沉默PARP1,采用Western blotting法、荧光实时定量PCR法以Elisa法验证PARP1对MT1M表达的影响。(6)在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3中过表达MT1M,采用SRB实验考察过表达MT1M对卵巢癌细胞增殖的影响;(7)在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3中过表达MT1M或敲除MT1M,采用Transwell实验和划痕愈合实验考察MT1M的表达对卵巢癌细胞迁移的影响;(8)在SKOV3细胞中过表达MT1M,并收集上清作条件培养基,考察MT1M的分泌对卵巢癌细胞迁移的影响;(9)在卵巢癌细胞OVCAR8上过表达PARP1,采用划痕实验考察PARP1的高度表达对卵巢癌细胞迁移的影响;同时在SKOV3和Ca OV3上敲除PARP1,采用Transwell实验考察沉默PARP1对卵巢癌细胞迁移的影响。研究结果:(1)PARP1 m RNA表达与与卵巢癌、乳头状肾细胞癌、ER~+乳腺癌、子宫体癌等的无疾病生存期呈负相关。而PARP1 m RNA的表达与膀胱癌、睾丸生殖细胞肿瘤、头颈鳞状细胞癌、以胰腺导管腺癌患者的无疾病生存期没有明显的相关性。(2)采用Kmplot数据库分析卵巢癌、子宫体癌、乳头状肾细胞癌、ER~+乳腺癌,这四种肿瘤中与PARP1表达呈负相关的基因,发现91个基因与PARP1的表达呈负相关。(3)在卵巢癌细胞OVCAR8上,分析过表达PARP1转录表达显著降低的基因,沉默PARP1转录表达显著增加的基因以给予Olaparib转录表达显著增加的基因,发现13个基因与PARP1的表达呈负相关。(4)对比重合分析TCGA数据库得到的91个基因与卵巢癌细胞OVCAR8基因芯片得到的13个基因,发现了与PARP1表达呈负相关的靶基因-MT1M。(5)在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3和OVCAR8,沉默PARP1,MT1M的转录表达显著增加,其蛋白表达也显著增加。同时发现敲除PARP1,能够促进MT1M的分泌。(6)过表达MT1M不影响卵巢癌细胞的增殖。在卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3上,过表达MT1M,通过SRB法检测细胞增殖,结果显示MT1M的高度表达对卵巢肿瘤细胞增殖没有影响。(7)MT1M的表达可影响卵巢癌细胞的迁移。在卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3上,过表达MT1M能够显著抑制卵巢癌细胞的迁移;而敲除MT1M,SKOV3的迁移能力显著增强。(8)MT1M的分泌可影响卵巢细胞的迁移。在SKOV3上,首先过表达MT1M,并收集过表达成功后的细胞上清作为条件培养基,再通过Traswell法发现过表达MT1M的条件培养基可显著抑制SKOV3细胞的迁移。(9)PARP1的表达可影响卵巢癌细胞的迁移。在卵巢癌细胞OVCAR8上,过表达PARP1,通过划痕实验法发现PARP1的高度表达可显著抑制卵巢细胞迁移;而敲除PARP1则明显抑制卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3的迁移能力。第二部分PARP1抑制卵巢癌MT1M转录的分子机制研究研究方法:(1)采用数据库预测分析潜在调控MT1M表达的转录因子,采用q RT-PCR实验考察在卵巢癌细胞SKOV3中,沉默预测的转录因子在Olaparib上调MT1M转录表达中的作用,筛选到转录因子FOXP3(Forkhead box 3);(2)考察FOXP3的表达对MT1M转录表达蛋白表达的影响;(3)采用免疫共沉淀方法,考察PARP1与FOXP3的结合情况;(4)采用检测PAR修饰的实验方法,考察PARP1对FOXP3核糖基化修饰的情况;(5)采用检测PAR修饰的实验方法,考察给予Olaparib对PARP1核糖基化FOXP3的影响;(6)采用核糖基化位点突变的PARP1(Flag-PARP1-E988K),考察位点突变Flag-PARP1-E988K对FOXP3核糖基化修饰的影响;(7)采用荧光素酶报告基因法,考察PARP1和Flag-PARP1-E988K对FOXP3介导的MT1M转录表达的影响;(8)采用Western blotting实验方法考察在卵巢癌细胞OVCAR8上,给予Olaparib和敲除PARP1对FOXP3蛋白表达的影响。研究结果:(1)PARP1通过FOXP3调控MT1M的转录首先,采用数据库预测分析MT1M潜在的转录因子,发现STAT1、STAT3、FOXP3和E2F1等转录因子可能是调控MT1M表达的转录因子,进一步采用q RT-PCR实验考察在卵巢癌细胞SKOV3中,沉默这些转录因子考察其在Olaparib上调MT1M转录表达中的作用,筛选到转录因子FOXP3即沉默FOXP3,Olaparib上调MT1M的作用消失。(2)FOXP3调控MT1M的转录表达蛋白表达在SKOV3细胞中过表达FOXP3和敲除FOXP3,采用western blotting和q RT-PCR实验方法考察过表达FOXP3和沉默FOXP3对MT1M转录蛋白表达的影响,发现过表达FOXP3能够显著增加MT1M的转录水平和蛋白水平;而敲除FOXP3则明显下调MT1M的转录蛋白水平。(3)PARP1与FOXP3直接结合。在293T细胞中,过表达Flag-PARP1和HA-FOXP3,采用免疫沉淀的方法,发现PARP1与FOXP3之间存在结合。(4)PARP1促使FOXP3发生核糖基化修饰在293T细胞中,过表达Flag-PARP1和HA-FOXP3,采用检测PAR修饰的方法,发现PARP1促使FOXP3发生核糖基化修饰。(5)Olaprib能够抑制由PARP1介导FOXP3发生核糖基化修饰在293T细胞中,过表达Flag-PARP1和HA-FOXP3,并给予Olaparib作用6h,采用检测PAR修饰的方法,发现给予PARP抑制剂Olaparib后则抑制PARP1促使FOXP3发生核糖基化修饰。(6)核糖基化活性突变的质粒Flag-PARP1-E988K不能使FOXP3发生核糖基化修饰。同时在293T细胞上,过表达Flag-PARP1-E988K和HA-FOXP3,采用检测PAR修饰的方法,发现Flag-PARP1-E988K不能使FOXP3发生核糖基化修饰。(7)PARP1通过调控FOXP3的核糖基化修饰从而调控MT1M的转录表达。在卵巢癌细胞SKOV3上,过表达Vector、HA-FOXP3、Flag-PARP1、Flag-PARP1-E988K、HA-FOXP3+Flag-PARP以HA-FOXP3+Flag-PARP1-E988K,采用荧光素酶报告基因法,发现HA-FOXP3促进MT1M的转录表达,而PARP1则抑制由FOXP3介导的MT1M的转录表达;PARP1-E988K由于其核糖基化功能缺失不影响由FOXP3介导的MT1M的转录表达。(8)在卵巢癌细胞中,给予Olaparib以沉默PARP1对FOXP3表达的影响在卵巢癌细胞OVCAR8上,给予Olaparib,发现FOXP3的蛋白表达随着Olaparib浓度的增加而增加;而在SKOV3和Ca OV3上敲除PARP1,则促进FOXP3的蛋白表达。第三部分PARP抑制剂促进MT1M表达抗卵巢癌转移的作用研究研究方法:(1)在卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR8中,给予不同浓度的Olaparib,采用Western blotting法、q RT-PCR法以Elisa法来考察Olaparib对MT1M蛋白表达、转录表达以分泌的影响;(2)在卵巢细胞SKOV3和Ca OV3上,给予不同的PARP抑制剂Olaparib、Veliparib和Niraparib,采用划痕愈合实验和Transwell小室法来考察不同的PARP抑制剂对卵巢细胞迁移的影响;(3)采用慢病毒构建MT1M稳定敲除的卵巢癌细胞SKOV3(sh-MT1M),再给予PARP抑制剂Olaparib,考察MT1M在PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞迁移中的作用;(4)采用尾静脉接种Ca OV3形成转移的裸鼠模型,给予Olaparib,考察PARP抑制剂对卵巢癌细胞转移的影响;(5)采用人源高转移卵巢癌PDX模型,通过腋下接种方式,并给予Olaparib,考察Olaparib对卵巢癌转移的影响,以MT1M在PARP抑制剂抗肿瘤转移中的作用。研究结果:(1)PARP抑制剂可以上调卵巢癌细胞MT1M转录表达以分泌在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3和OVCAR8上,给予浓度梯度的Olaparib,Western blotting法和q RT-PCR法检测MT1M的表达分泌,发现Olaparib浓度依赖上调MT1M的转录蛋白表达。同时给予不同的PARP抑制剂,采用Elisa法检测对MT1M分泌的影响,发现这些PARP抑制剂均能促进MT1M的分泌。(2)不同的PARP抑制剂均能明显抑制卵巢癌细胞的迁移在卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3,采用划痕愈合实验和Transwell小室法,考察不同抑制剂对卵巢癌细胞迁移的影响。结果显示不同的PARP抑制剂均能显著抑制卵巢癌细胞的迁移。(3)敲除MT1M能够显著抑制PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞迁移的能力构建稳定敲除MT1M的卵巢癌细胞株,在此基础上给予Olaparib作用,采用Transwell法检测对卵巢癌细胞迁移的影响。结果显示,敲除MT1M的卵巢癌细胞的迁移能力明显增强,而在敲除MT1M的卵巢癌细胞中给予Olaparib,发现Olaparib抑制卵巢癌细胞迁移的作用消失。(4)体内动物实验显示Olaparib可以显著卵巢癌转移,并促进MT1M的表达在尾静脉接种Ca OV3卵巢癌转移模型中,H&E染色结果显示Olaparib明显抑制肺内肿瘤转移灶点的形成。采用Elisa法检测血清中的MT1M,发现Olaparib促进MT1M的分泌。在人源高转移卵巢癌PDX模型,Olaparib抑制剂不影响肿瘤的生长。采用包氏固定法以H&E染色结果显示,Olaparib可以抑制卵巢细胞的肺转移。采用Western blotting法、q RT-PCR法以Elisa法来考察Olaparib对肿瘤内MT1M蛋白表达、转录表达以分泌的影响,结果显示Olaparib可以上调肿瘤内MT1M的转录表达以蛋白表达,并促进MT1M的分泌。研究结论:本研究发现PARP1新的靶基因MT1M,且在卵巢癌细胞中PARP1负性调控卵巢癌细胞MT1M的表达;而MT1M的高度表达能够抑制卵巢癌细胞迁移但不影响肿瘤细胞增殖;进一步研究发现FOXP3调控MT1M的表达并参与PARP1负性调控MT1M的转录表达,即PARP1与FOXP3结合使FOXP3发生核糖基化修饰,抑制FOXP3的转录活性,进而抑制MT1M的转录表达。体内动物实验验证了PARP抑制剂Olaparib确实能够抑制卵巢癌细胞的转移,促进肿瘤细胞表达MT1M。本研究不仅发现了调控卵巢癌转移的新机制,也为PARP抑制剂在卵巢癌治疗中的应用提供新的理论依据。