狂犬病毒(Rabies virus, RV)属于弹状病毒科狂犬病毒属的单股不分节段的负链RNA病毒,具有高度嗜神经性和致死性。基因组全长约为12kb,分别编码糖蛋白(G)、核蛋白(N)、基质蛋白(M)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)。目前对该病毒与宿主细胞相互作用的机制认识相对有限,致病机制仍不甚明了。本研究对RV感染的宿主细胞差异表达蛋白进行分析,旨在为探讨RV对宿主细胞的致病作用和寻找潜在的药物靶标奠定基础。单克隆抗体是疾病诊断、预防、治疗以及免疫机制研究的有力武器,除商业化的糖蛋白单克隆抗体,无针对RV其他蛋白的单克隆抗体。本研究将RV核蛋白重组表达载体pET32a-NP和糖蛋白重组表达载体pET32a-GP分别诱导表达,用变性纯化的表达蛋白免疫BALB/c小鼠,成功制备了9株抗RV核蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞和1株抗RV糖蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞。同时,通过以自制的狂犬病毒感染乳鼠脑组织悬液为抗原免疫小鼠,取脾细胞与sp2/0细胞融合,成功获得了7株为抗RV磷蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞。为了探索病毒与宿主细胞的相互作用,本研究选择鼠成神经瘤细胞N2a为感染模型,采用二维凝胶电泳技术结合质谱鉴定的经典比较蛋白组学方法,分析了N2a细胞在感染RV后24h、48h和96h的差异蛋白表达谱。PDQuest软件分析结果显示,RV感染N2a细胞后,共出现了97个差异表达的蛋白点,差异表达的蛋白点主要出现在感染后48h和96h,且多数蛋白点呈现上调表达趋势。串联质谱MALDI-TOF/TOF对差异蛋白点进行鉴定,成功鉴定出对应49种差异蛋白的53个蛋白点。这些差异蛋白的功能涉及蛋白合成与加工、能量代谢、信号转导、应激反应／伴侣蛋白、基因调控、免疫反应和泛素——蛋白酶体通路。设计引物,并通过适时荧光定量PCR对其中的27个差异蛋白对应基因转录本的变化进行了验证,一定程度上确证了质谱鉴定结果的可靠性。免疫印迹实验验证了HSP90和CCTγ在感染组和对照组中上调表达的差异。针对差异表达蛋白,基于Ingenuity生物网络分析软件IPA绘制了这些差异蛋白的相互作用网络。上述差异表达蛋白信息和蛋白相互作用网络为进一步解析狂犬病发病机制提供了重要的蛋白组学信息。依据比较蛋白组学信息,采用间接免疫荧光双标技术进一步分析了RV感染细胞CCTα、CCTβ、CCTγ、HSP90、PFDN1和DLC8的亚细胞分布。结果表明,病毒感染引起了细胞CCTα和CCTγ蛋白在内氏小体部位的高度募集,PFDN1和DLC8在该部位的部分聚集,CCTα和CCTγ与病毒N、P蛋白能够很好的共定位；而CCTβ和HSP90则无明显的内氏小体部位募集现象。共转染RVN和P的细胞内也形成类似内氏小体的结构,且在该结构中出现与感染细胞类似的现象,CCTγ、CCTα、PFDN1和DLC8与内氏小体中N、P蛋白发生共定位。单独转染N或P的细胞中也出现不同程度的CCTγ和CCTα与N或P的共定位。荧光定量结果表明感染细胞中DLC8、CCTγ和HSP90均呈现出转录上调,而CCTα、 CCTβ、PFDN1则变化不明显；而P质粒单转以及与N质粒共转N2a细胞引起了DLC8的转录水平上调,这可能与P和DLC8的相互作用有关,而其他蛋白则变化不显著。这都说明,这些宿主细胞蛋白主动或被动的参与了病毒的生命活动。鉴于CCTγ在蛋白组学上的表达差异及亚细胞定位上的分布变化,有必要对其在狂犬病毒生命周期中的具体功能进行探索。本研究通过慢病毒介导的shCCTγ、shCCTα和无义序列shcoo2v(?)勺转导建立了稳定表达shCCTγ、shCCTα的RNA干扰细胞系,通过病毒接种,TCID50测定以及适时荧光定量PCR分析,发现CCTγ和CCTα的敲除能够降低狂犬病毒的复制以及病毒各基因的转录水平,表明CCTγ和shCCTα对于狂犬病毒的复制和转录是重要的。