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海藻糖(Trehalose，α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside)是由两个葡萄糖分子经半缩醛羟基结合而成的非还原性双糖，含有海藻糖的特殊生物具有脱水条件下存活多年的性质，其中还有一种被称为隐生生物的生物体内的99％的水分被去掉后，竟仍能保持着获水之后迅速复活的能力。研究表明，除了在脱水条件下生物体积累海藻糖以外，在高温、高渗透压、重金属及有毒试剂等条件下生物体也合成并积累海藻糖，其被认为是生物体抵御胁迫环境的应激代谢物。对这一现象的深层次研究表明，海藻糖可以对生物膜、蛋白质和核酸等生物大分子发挥保护作用，从而使富含这种奇妙化合物的生命体对外界的恶劣环境表现出独特的生物学特性。 本研究旨在利用基因工程技术，研究磷酸-6-海藻糖合酶(TPS1)基因在大肠杆茵中的克隆与表达，对进一步构建海藻糖的高产基因工程菌株打下基础，所以本研究的主要目标就是，构建一个包含强启动子的高效表达载体，使磷酸-6-海藻糖合酶基因在大肠杆菌中高效表达。 本研究根据Genebank发表的酿酒酵母磷酸-6-海藻糖合酶基因序列，设计了一对引物，以本实验室分离并诱变所得的一株高产海藻糖酵母茵提取的总RNA为模板，应用反转录PCR(RT-PCR)的方法，扩增出了TPS1基因序列。将扩增出的基因与T载体连接，用这个重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，使目的基因在受体茵中得到了复制，提取此重组茵的质粒酶切和PCR鉴定，证明了目的基因已经克隆入该受体大肠杆菌DH5α中，过夜培养含有重组质粒的阳性茵，加入甘油至终浓度为20％保存。经基因测序，得知扩增基因全长为1507bp(其中包括3′端和5′端分别含所设计的限制性酶切位点和保护碱基共19个)，实际基因全长1488bp，含有起始密码和终止密码，为一完整的开放阅读框架，编码496个氨基酸，该序列与Genebank上发表的酿酒酵母TPS1基因同源性达到99.6％，拟推导的氨基酸同源性达99.6％。可以进行下一步表达试验。 在进行克隆试验过程中，在提取酵母总RNA时对当前流行的Trizol一步RNA提取法进行了改造，使之更适合于酵母RNA的提取，且提取的RNA在纯度和完整性方面大大吉林农业大学硕士学位论文酵母菌中海藻搪合成酶墓因的克隆及高效表达载体的构建提高。在进行RT一PcR过程中，针对几个对PcR反应影响比较大的因素设计了正交实验进行了反应条件的优化，最终确定的各因素加入量分别为Taq酶1 .su，模板10nq，dNTP(1OI’nIno1/L)1川，上、下游引物各60PInol，镁离子终浓度为2 .5~1/L。反应条件为94℃，5 05 55一52℃，loin3os 72℃，2讯in共30个循环，最后一个循环72℃，10min。 由T载体和目的基因构成的重组质拉用BalnHI和Pst工双酶切之后，定向插入用这同样两种酶切的表达载体PUcls中，构建出表达载体PHY肚，同样方法用sac工和BalnHI双酶切重组质粒和PET一2 sa载体，并重新连接，构建出表达载体PHY02，两种表达载体经PcR反应和酶切反应鉴定后，都证明目的基因成功与载体连接。用这两个重新构建的质拉转化受体菌BL21，用工PTG诱导，成功的表达出了酶蛋白。经过对重组菌的海藻糖提取定量分析后，证明表达的磷酸一6一海藻糖合酶具有一定的活性，但要提高产量还有待进行深入的研究。 综上，本研究为最终构建高产海藻糖的基因工程大肠杆菌的目标打下了坚实的基础。