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牙周膜组织是牙齿重要的支持组织,具有较强的适应性改建能力,这与其在咀嚼功能状态下不断承受周期性的咬合轻力刺激有关。2004年,随着牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)的成功分离与培养,大量的研究已经证实,牙周膜干细胞是牙周膜组织中增殖分化能力较强的细胞簇,应力刺激下其活性高低直接关系到牙周组织的健康。研究表明,将体外培养的PDLSCs用于脱位牙再植,可促进患牙牙周愈合,但愈合效果并不理想。分析原因主要为以下三个方面:PDLSCs单细胞悬液易流失;体外培养的PDLSCs其增殖及分化缺乏生长因子调控;体外培养的PDLSCs缺少体内生物力学微环境的调控。针对前两个问题,本课题组在前期研究中将体外培养的PDLSCs诱导形成细胞膜片,防止细胞流失。并且制备富血小板纤维蛋白(Platelet-rich fibrin,PRF)为PDLSCs的生长提供支架及生长因子微环境。前期研究将PDLSCs和PRF构建为PDLSCs/PRF双膜复合体用于脱位牙再植,结果表明该复合体可有效促进脱位再植牙的牙周愈合。但作为牙齿的支持组织,牙周膜需承受咀嚼力、咬合力、正畸力等多种应力刺激,这种生物力学微环境在牙周膜再生修复中至关重要。大量临床研究表明无论采用何种促牙周再生的措施,对再植牙施以弹性固定,保持其生理动度和咬合力刺激在牙周膜再生中必不可少,但其机理尚不明确。研究发现,机体组织中存在一种力生长因子(mechano-growthfactor,mgf)该因子为力学敏感因子,在正常组织中不表达,但当组织受到损伤或应力刺激后该因子会被诱导表达。目前已经发现肌肉、神经、心脏等多种组织损伤或受应力刺激后可表达mgf,但其在牙周组织中的表达及功能尚未见报道。目的:本实验以本课题组前期研究为基础,制备hpdlscs/prf(humanperiodontalligamentstemcells/prf,hpdlscs/prf)间接共培养体系,并对其加载周期性动态压力,分析动态压力作用下hpdlscs/prf间接共培养体系中mgf在hpdlscs中的响应以及hpdlscs的增殖和分化,为进一步探讨咬合力促进牙周再生的机理提供实验基础,也为牙撕脱性损伤的临床治疗提供新的思路与契机。本实验分为三个部分:实验一:hpdlscs的分离培养及细胞膜片的构建。联合应用组织块法与酶消化法分离培养人牙周膜细胞,并用有限稀释法分离hpdlscs,采用表面标记物鉴定、克隆形成率测定、成骨诱导和成脂诱导对其干细胞特性进行鉴定。采用mtt法测定hpdlscs的生长曲线。利用成膜诱导液将hpdlscs诱导形成细胞膜片。结果表明:采用有限稀释法能分离得到的hpdlscs具有良好的增殖及克隆形成能力,表达间充质干细胞表面标志分子,并且具有向成脂、成骨向细胞分化的潜能。且诱导形成的细胞膜片具有丰富的细胞外基质。实验二:动态压力对hpdlscs增殖分化的影响及其mgf响应。对体外培养的hpdlscs及细胞膜片加载0-90kpa、0-120kpa、0-150kpa、﹣20-90kpa、﹣20-120kpa、﹣20-150kpa、﹣40-90kpa、﹣40-120kpa和﹣40-150kpa,频率为0.1hz,持续时间为1h的周期性动态压力。采用cck-8法检测hpdlscs细胞活性,real-timepcr法检测细胞膜片中mgf、igf-1、col-Ⅰ、alp、runx2和pcna基因表达水平。结果表明:0-120kpa及﹣20-120kpa的周期性动态压力作用下hpdlscs细胞活性显著增强。且各组压力作用后12h至36h,hpdlscs膜片中mgf基因的表达水平显著增高,且mgf在压力作用后24h达到表达高峰。其中0-120kpa压力作用下mgf的表达量最高,而﹣20-120kpa作用下mgf的表达量次之;此外,研究发现0-120kpa压力作用下col-Ⅰ、alp、runx2和pcna基因的表达量显著增高。根据以上结果,本研究筛选出mgf表达量较高的两个压力值0-120kpa和﹣20-120kpa作为后续实验的压力加载条件。实验三:动态压力对hPDLSCs/PRF间接共培养体系中h PDLSCs分化的影响及其MGF响应选取0-120 kPa、﹣20-120 kPa对hPDLSCs/PRF间接共培养体系进行周期动态力学加载。采用Real-time PCR法检测间接共培养体系中MGF、IGF-1、Col-Ⅰ、ALP、RUNX2和PCNA mRNA的表达水平,采用Western Blotting法和免疫组化法检测间接共培养体系中的MGF与IGF-1蛋白的表达。结果表明:0-120 kPa与﹣20-120 kPa压力作用下hPDLSCs/PRF间接共培养体系中的MGF、IGF-1 mRNA的表达量显著增高。且与压力作用下h PDLSCs膜片相比,压力作用下的间接共培养体系中MGF mRNA的表达量显著升高。0-120 kPa作用下的hPDLSCs/PRF间接共培养体系中Col-Ⅰ、ALP、RUNX2和PCNA mRNA的表达量显著增高。而﹣20-120 kPa作用下仅Col-Ⅰ及PCNA mRNA表达量显著升高。0-120 kPa与﹣20-120 kPa压力作用下hPDLSCs/PRF间接共培养体系中MGF蛋白的表达量显著增高,且高于hPDLSCs膜片组。结论:在课题组前期研究的基础上,本研究构建出hPDLSCs/PRF间接共培养体系。并且模拟牙周膜在体内所承受的咬合力,对体外培养的hPDLSCs及hPDLSCs/PRF间接共培养体系加载周期性动态力学刺激,观察力学环境下hPDLSCs膜片及间接共培养体系中hPDLSCs增殖分化及MGF响应。研究发现适宜的周期性动态压可促进hPDLSCs的增殖与分化,并诱导MGF表达,且在压力作用之后的24h,MGF达到表达峰值。本研究首次发现周期性动态压力作用下hPDLSCs中表达MGF。研究还发现适宜的周期性动态压力可促进hPDLSCs/PRF间接共培养体系hPDLSCs的增殖与分化,且PRF与适宜周期性动态压力作用可协同促进hPDLSCs中MGF的表达。本研究模拟牙周膜力学微环境,以力敏感因子MGF为中心,初步探讨了力学信号在牙周膜中的传导机制。并将力学微环境与hPDLSCs/PRF间接共培养体系结合,为力学微环境作用下的牙周膜组织工程应用提供实验基础,也为牙周膜组织工程在撕脱牙再植的临床应用提供了新的思路。