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目的 构建能抑制HPV16 E6/E7基因活性的稳定表达siRNA的重组载体。为进一步研究其干扰系统对HPV16 E6/E7基因活性的抑制作用打下基础,也给我们以后研究HPV16 E6/E7基因的功能以及宫颈癌的基因治疗提供了新的技术和方法。 方法 ①应用美国Oligoengine公司的target siRNA design tools设计软件设计并化学合成各60个碱基的编码短发夹RNA序列的、分别靶向HPV16 E6/E7基因的寡核苷酸正反义链。②将寡核苷酸正反义单链进行退火形成双链。③Bgl Ⅱ、HindⅢ双酶切处理pSUPER.Retro逆转录病毒载体。④将酶切后的载体和退火后的双链寡核苷酸进行体外连接构建重组载体,同时设立阴性对照。⑤采用1×TSS两步法将重组载体转化感受态细胞JM109,筛选阳性转化子,用碱裂解法提取。⑥用EcoR Ⅰ-HindⅢ双酶切鉴定阳性克隆,同时以空质粒做阴性对照。⑦PCR鉴定阳性克隆,引物应用DNA Star设计软件设计。⑧测序鉴定阳性克隆。 结果 ①BglⅡ、HindⅢ双酶切处理后的pSUPER.Retro载体经过电泳鉴定证明酶切成功。分别切出7.3Kb和0.9Kb大小的片断。②重组构建的pSUPER.Retro—16 E6和pSUPER.Retro—16 E7载体经EcoR Ⅰ-HindⅢ双酶切电泳分析可产生7.1Kb和281bp大小的两条DNA条带,而在空质粒的泳道出现7.1Kb和1204bp大小的两条DNA条带。③DNA Star设计软件设计引物,重组载体用PCR方法扩增产物长度是384bp,而阴性对照的空质粒扩增产物的长度为1207bp。④插入基因片断序列的测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计的位点,并且序列完全一致。 结论 抑制人类宫颈癌细胞中HPV16 E6/E7基因活性的siRNA表达载体构建成功。