水稻叶片形态是理想株型的重要指标之一,与光合效率密切相关,进而影响水稻产量的最终形成。水稻是一个多型性作物,叶片的变异也极其多样。在一般的栽培品种中,水稻叶片通常为平展叶,少数品种的叶片为卷叶、窄叶等。迄今为止,尽管已经克隆了部分叶片发育相关基因,人们对控制叶片发育的分子机理认识得十分有限。因此,通过继续克隆更多的窄叶和卷叶基因,阐明叶片生长发育的分子机理,不仅具有很高的理论意义而且具有很大的实际利用价值。本研究利用60Co-γ射线辐射籼稻品种93-1 1,获得了3份突变体:dn11、rl3(t)-1和r13(t)-2。其中,突变体dnll表现为动态窄叶；突变体r13(t)-1和rl3(t)-2表现为典型的卷叶。本研究对这3份突变体材料分别进行了突变体表型鉴定、遗传分析、基因定位以及图位克隆,并且对rl3(t)-1和rl3(t)-2突变体进行了等位性检测,对DNL1基因的功能进行了分析,主要研究结果如下：一、动态窄叶基因DNL1的克隆和功能鉴定1、本研究通过辐射获得一个水稻动态窄叶突变体(dynamic narrow leaf1, dnl1),形态鉴定表明,与野生型品种93-11相比,突变体dnl1在播种后长出的叶片宽度正常,但是长出的第10叶会变得非常的窄,之后长出的叶片会逐渐变宽,但是仍然比93-11窄,直到第14叶宽度才会恢复正常。突变体dnl1的另一个显著特征是根毛的生长发育受阻,侧根数量也明显减少。此外,突变体dnl1的株高变矮,穗长变短,穗粒数减少,育性变低。突变体dnl1叶片边缘锯齿状刚毛的发育也受影响。2、将dnl1突变体与93-11配制杂交,F1叶片宽度与野生型相似,F2中正常株和突变株的分离比符合3：1,表明突变性状受单隐性基因控制。利用dnl1突变体与粳稻品种武运粳8号和武运粳7号杂交产生的F2、F3群体,运用SSR、STS和CAPS标记,将DNL1基因定位在第1染色体PAC克隆AP002972和AP003768之间20kb的区段上。3、通过基因预测发现,在DNL1基因所在的20kb内,仅有一个ORF,编码Aux/IAA响应蛋白(OsIAA6)。对该基因的测序结果表明,突变体dnl1在一个内含子中发生三个单碱基替换,一个外显子发生了单碱基替换,并且在启动子序列发生一个单碱基替换和两个碱基的插入。互补实验表明：在突变体dnll背景下,导入了野生型基因OsLAA6的转基因植株,其叶片形态在整个生育期表现正常,根毛和侧根的生长发育也恢复正常。这些结果都说明,OsIAA6就是DNL1基因的候选基因。4、荧光定量RT-PCR结果表明,DNL1/OsIAA6基因在所有的器官中都有表达,包括根、茎、叶片、叶鞘和幼穗。进一步的将DNL1基因启动子与GUS基因融合导入水稻植株中,该基因呈组成型表达特征,特别是在根和根毛中表达最为强烈。亚细胞定位分析表明,转DNL1/OslAA6-GFP融合基因的植株原生质体中,仅在细胞核中能够观察到荧光,说明该蛋白是一个核定位蛋白。5、大田实验和人工气候箱实验结果显示,dnll突变体叶片形态受温度调控。当环境温度达到30℃左右时,dnll突变体长出的叶片宽度显著变窄。进一步研究发现,窄叶的出现可能与DNL1/OsIAA6的表达量有关,该基因表达量较低时会出现窄叶。6、用不同浓度的NAA处理93-11和dnll,结果显示dnl1突变体对于外源生长素处理的敏感程度要比93-11低,而在低浓度NAA条件下,突变体dnll的根毛缺失表型可以得到恢复。此外,重力实验表明,dnll突变体的向重力性与野生型相比也受到了抑制。7、通过RNA干涉下调候选基因DNL1/OsIAA6的表达量,可导致动态窄叶的发生和根毛的伸长受到抑制,这些表型均与突变体dnll表型相似。8、已有研究表明,OsZHD1、ADL1、SRLl和NRL1基因与叶片的形态建成有关,OsZHD1的表达量升高会导致叶片卷曲,而ADL1、SRL1和NRL1基因的表达量降低会导致叶片卷曲、变窄。本研究中,ADL1、SRL1和NRL1基因在突变体dnll中表达量均比在93-11中显著降低,而OSZHD1的表达量显著升高,说明当DNL1/OSIAA6表达降低后,会引起上述基因表达的变化,暗示了这些基因可能处于DNL1/OSIAA6基因的下游。与此类似,已有研究发现OsAPY基因与根毛的生长发育相关,当OsAPY基因表达下降时,根毛伸长受到明显抑制。在dnll突变体中,OsAPY基因的表达量也明显下降,表明OsAPY基因也是处于DNL1/OsIAA6基因调控途径的下游。二、卷叶基因RL3(t)的精细定位1、形态分析表明,与野生型93-11相比,突变体r13(t)-1和r13(t)-2叶片显著内卷,株高降低,穗长变短,并且结实率降低。细胞学分析表明,突变体叶片中泡状细胞数量减少,泡状细胞的形态也发生了改变,推测突变体叶片卷曲可能是由于泡状细胞数量和形态改变所致。2、以突变体r13(t)-1和rl3(t)-2分别与93-11,和武运粳8号杂交,Fl均表现为野生型性状,叶片无卷曲现象。在F2群体中发生了性状分离,其中,卷叶植株的数目明显偏少,正常植株与突变表型植株的比例偏离了孟德尔的理论分离比例(3：1)。将两个突变体rl3(t)-1和rl3(t)-2相互杂交,F1表现为卷叶。这说明控制这两个卷叶突变体表型的基因是等位的。3、以卷叶突变体rl3(t)-1与武运粳8号杂交衍生的F2和F3分离群体作为定位群体,利用SSR标记和新发展的STS标记和·CAPS标记,将RL3(t)基因定位于第3号染色体长臂上STS标记S3-36与CAPS标记SAL1之间约23kb长的区间内。4、生物信息学分析表明,在23kb区间内有4个注释基因,其中存在1个编码含F-box结构域蛋白的基因、1个锌指蛋白基因、1个淀粉酶基因以及1个叶绿素还原酶基因。