【摘 要】
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水温是影响贝类生长、存活、免疫和分布的主要环境因子之一。全球气候变暖和极端天气频率增加致使海区温度逐年升高。生活在潮间带的贝类极易受到水温变化的影响。缢蛏作为典型的滩涂广温性贝类,对温度变化适应能力极强,在8-30℃水中均能正常生活。与其他潮间带生物不同,其活动范围有限,无法迅速躲避骤变环境胁迫,因此,可能进化出特殊的防御机制以抵御外界环境胁迫,使得其对高温耐受性更强。但夏季高温仍是影响其生长和诱
【基金项目】
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国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”专项“蛏蚶优质、抗逆种质创制和规模化制种”（2018YFD0901405）； 浙江省农业新品种选育重大科技专项“缢蛏高产、抗逆新品种培育”（2016C02055-9）；
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水温是影响贝类生长、存活、免疫和分布的主要环境因子之一。全球气候变暖和极端天气频率增加致使海区温度逐年升高。生活在潮间带的贝类极易受到水温变化的影响。缢蛏作为典型的滩涂广温性贝类,对温度变化适应能力极强,在8-30℃水中均能正常生活。与其他潮间带生物不同,其活动范围有限,无法迅速躲避骤变环境胁迫,因此,可能进化出特殊的防御机制以抵御外界环境胁迫,使得其对高温耐受性更强。但夏季高温仍是影响其生长和诱发疾病的重要环境因素之一。因此,开展缢蛏高温适应性研究、筛选功能基因对其耐高温机制的了解和后续分子标记的开发具有重要意义。在水生生物中,鳃为主要的呼吸代谢器官,直接与水接触,能直接感受水温的变化并迅速做出反应;肝胰腺为主要的代谢与免疫器官,对环境应激响应敏感。因此,本研究用Illumina测序平台对缢蛏肝胰腺和鳃进行转录组测序,并对差异基因进行筛选和功能验证,以期为缢蛏高温耐受机制的研究提供理论基础。1.对缢蛏高温胁迫24 h后,对照组（22℃）和实验组（32℃）各3粒鳃和肝胰腺进行转录组测序,结果显示,鳃和肝胰腺分别得到556和786个差异基因（DEGs）,鳃中上、下调基因分别为311和245个;肝胰腺上、下调基因为分别456和330个。GO和KEGG分析表明,DEGs主要参与维持细胞稳态、代谢与氧化应激、细胞骨架和免疫应答等过程。为进一步验证转录组数据的准确性,用qRTPCR技术对17个DEGs进行验证,结果发现qRT-PCR和RNA-seq表达模式基本一致。分析显著上调的4个基因,热休克蛋白70（HSP70）、94 kDa葡萄糖调节蛋白（GRP94）、DNAJ同源B亚家族4（DNAJB4）和细胞色素P450 1A2（CYP1A）在不同物种中的结构域,发现4个基因在不同物种中相对保守,且具有相同的结构域。组织表达结果显示,HSP70、GRP94、DNAJB4和CYP30分别在鳃、外套膜、足和肝胰腺中表达量最高。2.用qRT-PCR技术对转录组中筛选的分子伴侣（HSP70、HSF1、GRP94、PDIA6、CALR）、免疫应答（CTL、CTSL）和细胞凋亡（caspase-3、p53）3类高温应答相关基因在不同温度（30℃、32℃、34℃）胁迫下鳃和肝胰腺中的表达特征进行分析。结果显示,高温胁迫后,3类基因在鳃和肝胰腺中均有不同程度的表达,其中分子伴侣基因对温度响应更显著,随胁迫时间的延长呈先升高后下降趋势。鳃中分子伴侣基因在4 h时开始上调,相比肝胰腺较为敏感;免疫应答相关基因在肝胰腺中表达较为明显,随胁迫时间延长呈先升高后下降趋势;细胞凋亡基因随温度升高和胁迫时间的延长均呈先升高后下降趋势,且在肝胰腺中的表达较为滞后。3.对ScDIA6基因进行验证,其开放阅读框（ORF）为1331 bp,编码436个氨基酸,包含由18个氨基酸组成的信号肽和两个硫氧还蛋白结构域。系统进化树显示,ScPDIA6与贝类同源性较高。qRT-PCR结果显示,ScPDIA6在外套膜表达量最高。高温胁迫后,鳃、肝胰腺和心脏中ScPDIA6 m RNA表达量显著升高（P<0.05）。不同温度胁迫结果显示,ScPDIA6在外套膜和鳃中的变化显著（P<0.05）,其表达量与温度呈正相关,随胁迫时间的延长,总体呈先升高后下降趋势,鳃比外套膜响应更显著。原核表达结果显示,pET-32a-PDIA6蛋白的最适表达温度为28℃,目的蛋白主要以包涵体形式表达。4.对ScCALR基因进行验证,其ORF为1221 bp,编码406个氨基酸,包含有16个氨基酸组成的信号肽,为无跨膜结构的亲水性内质网蛋白。系统进化树显示,ScCALR与贝类同源性较高。qRT-PCR结果显示,ScCALR在所有组织中均有表达,其中在肾脏中表达量最高。高温胁迫后,鳃、肝胰腺和心脏中表达量显著升高（P<0.05）。不同温度胁迫结果显示,ScCALR在鳃中的表达变化显著（P<0.05）,其表达量随温度升高总体呈先升高后下降趋势,随胁迫时间的延长呈先升高后下降再上升趋势。原核表达结果显示,pET-32a-CALR蛋白的最适表达温度为37℃,且为可溶性蛋白。
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