椎间盘退行性疾病在临床上极为常见,是导致45岁以下人群劳动能力受限的最主要原因,每年都造成巨大的经济损失和社会负担。髓核退变是椎间盘退变过程的开始,并且髓核细胞减少和髓核基质合成与降解失衡是其主要的始动因素。细胞移植是针对椎间盘退变病因的治疗方法,其中脂肪间充质干细胞(Adipose-derived Stem cell, ADSC)在既往的研究中用于退变椎间盘的干细胞治疗。而随着预处理方法的提出,间充质干细胞经成髓核细胞诱导分化后获得的细胞被认为是用于退变髓核修复的细胞来源之一。此外,Ⅱ型胶原作为髓核内细胞外基质的重要组分,是正常髓核组织主要存在的胶原类型,具有良好的生物相容性和降解特性,是用于髓核修复的天然细胞载体材料。在本研究中,通过体外研究TGF-β3和IGF-1生长因子联合应用诱导ADSCs成髓核细胞分化,及Ⅱ型胶原对ADSCs增殖、分化等生物学活动的影响,并在体研究Ⅱ型胶原荷载成髓核细胞分化的ADSCs修复猪退变椎间盘,验证其修复效果。本研究分为以下四个部分：(1) TGF-β3和IGF-1联合诱导脂肪间充质干细胞成髓核细胞定向分化；(2)细胞外基质中Ⅱ型胶原含量对脂肪间充质干细胞成髓核细胞分化的影响；(3)转录因子FoxA2参与Ⅱ型胶原诱导脂肪间充质干细胞成髓核细胞分化；(4)Ⅱ型胶原荷载成髓核细胞分化的脂肪间充质干细胞修复猪退变椎间盘。第一章TGF-β3和IGF-1联合诱导脂肪间充质干细胞成髓核细胞定向分化目的：研究TGF-β3和IGF-1联合作用诱导脂肪间充质干细胞(ADSCs)成髓核细胞定向分化的作用及其机制。方法和结果：ADSCs的增殖和生存率分别通过CCK-8法及流式细胞方法检测。细胞三维微球培养用于成髓核细胞分化的检测。分化后细胞SOX9、I型胶原、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、核心蛋白聚糖的表达通过实时定量PCR及蛋白免疫印迹检测。细胞外基质的沉积通过硫酸糖胺聚糖评估。软骨细胞和髓核细胞的特异性表型基因用于鉴别细胞分化类型。并对分化过程中MAPK/ERK和TGF/Smad信号通路进行了检测。TGF-β3和IGF-1联合作用能增加ADSC的生存率,细胞外基质合成以及成髓核细胞分化的能力。TGF-β3和IGF-1的联合作用是通过激活MAPK/ERK信号通路实现的。结论：TGF-β3和IGF-1联合作用能促进ADSC的生存及成髓核细胞分化的能力,可能应用于在体研究促进退变椎间盘的修复。第二章 细胞外基质中Ⅱ型胶原含量对脂肪间充质干细胞成髓核细胞分化的影响目的：椎间盘退变过程中,髓核组织的Ⅱ型胶原分解和Ⅰ型胶原合成增强可能会影响移植后干细胞的生物学活性,体外研究细胞外基质中Ⅲ型胶原含量对脂肪间充质干细胞成髓核细胞分化的影响。方法和结果：ADSCs三维微球培养或者培养在梯度变化的Ⅰ/Ⅱ型胶原支架中。细胞的增殖和凋亡分别通过CCK-8法和LDH法检测。细胞中SOX9、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达通过实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测。软骨细胞和髓核细胞的特异性表型基因用于鉴别细胞分化类型。阿尔新蓝染色和DMMB法用于检测细胞外基质中硫酸糖胺聚糖的沉积。并对PI3K/AKT, MAPK/ERK和TGF/Smad信号通路进行了检测。结果表示,胶原支架具有良好的生物安全性。Ⅱ型胶原能够部分促进ADSCs增殖。SOX9、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达以及硫酸糖胺聚糖的合成与Ⅱ型胶原在支架中的比例成正相关。髓核细胞特异性表型基因角蛋白19仅在单纯Ⅱ型胶原处理组中高表达。此外,Ⅱ型胶原对ADSCs诱导分化机制,可能是通过激活ADSCs中MAKP/ERK通路进而上调磷酸化Smad3的表达。结论：Ⅱ型胶原促进.ADSCs成髓核细胞分化并增强其细胞外基质合成能力。椎间盘退变过程中,髓核组织的Ⅱ型胶原分解和Ⅰ型胶原合成增强对ADSCs的分化及基质合成能力有负面影响。第三章转录因子FoxA2参与Ⅱ型胶原诱导脂肪间充质干细胞成髓核细胞分化目的：Ⅱ型胶原是正常髓核的主要细胞外基质成分。转录因子FoxA亚家族成员在中轴和椎间盘发育中有重要作用。研究转录因子FoxA2可能参与的Ⅱ型胶原诱导脂肪间充质干细胞成髓核细胞分化过程。方法和结果：ADSCs培养在不同浓度Ⅱ型胶原包被的培养器皿上。细胞中SOX9、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达通过实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测,角蛋白19及FoxA1/A2/A3的表达通过实时定量PCR检测。并且通过免疫荧光检测FoxA2的表达及分布。通过慢病毒过表达和敲低ADSCs中FoxA2的表达用于研究Ⅱ型胶原诱导分化的可能机制。细胞中SOX9、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和角蛋白19的表达和Ⅱ型胶原处理浓度及时间(14天内)具有正相关。FoxA2在Ⅱ型胶原处理的ADSCs中高表达。过表达FoxA2增强Ⅱ型胶原的诱导分化作用,反之,敲低FoxA2抑制其作用。并且Ⅱ型胶原通过激活ADSCs中MAPK/ERK信号通路上调FoxA2的表达。结论：Ⅱ型胶原诱导ADSCs成髓核细胞分化的作用与处理剂量和时间呈正相关。FoxA2是参与Ⅱ型胶原诱导分化作用的关键转录因子。第四章 Ⅱ型胶原荷载成髓核细胞分化的脂肪间充质干细胞修复猪退变椎间盘目的：研究Ⅱ型胶原荷载成髓核细胞分化的脂肪间充质干细胞修复巴马小型猪退变椎间盘模型的作用。方法和结果：分离、培养和鉴定巴马小型猪ADSCs。通过针刺法进行巴马小型猪退变椎间盘造模,并根据腰椎不同节段分组情况进行处理：对照组(NC) L1-L2,不造模,不处理;退变组(DC) L2-L3,造模后注射DMEM高糖培养基；预分化ADSCs注射组(SC) L3-L4,造模后注射成髓核细胞分化的ADSCs;不含细胞的Ⅱ型胶原注射组(CII) L4-L5,造模后注射Ⅱ型胶原；含预分化ADSCs的Ⅱ型胶原注射组(SC-CII) L5-L6,造模后注射成髓核细胞分化的ADSCs和Ⅱ型胶原。在各时间点,通过MRI评估椎间盘情况。处理后第24周,对椎间盘进行组织学及免疫组织化学检测,并对髓核进行生物化学、实时定量PCR和蛋白免疫印迹检测。影像学、组织学等评估结果显示,DC组椎间盘明显退变。SC、CII和SC-CII组与DC组相比具有修复效果,且SC-CII组的修复效果最佳,SC组次之。SC-CII组的椎间盘各项评估结果与NC组相似。结论：Ⅱ型胶原荷载成髓核细胞分化的ADSCs可以有效治疗巴马小型猪的退变椎间盘。