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庆大霉素是临床上重要的氨基寡糖类抗生素,其生物合成代谢流研究,已取得了一些进展,但其生物合成过程所涉及的重要修饰基因,绝大多数尚未确定。本研究根据文献报道和生物信息学分析,锁定庆大霉素生物合成基因簇上的genQ、genB2和genD2三个重要修饰基因,以庆大霉素产生菌绛红小单孢菌G1008为对象,采用基因工程技术进行敲除,分析基因敲除后的突变株对庆大霉素系列产物生物合成的影响,借助分子遗传学试验,阐明基因功能,以及获得相应的工程菌。基因genQ功能的研究：以温敏型穿梭质粒pKC1139为载体,构建敲除基因genQ重组质粒pQB303,通过接合转移,将质粒导入绛红小单孢菌G1008中,得到单交换菌株GQ1,经松弛培养,单菌落影印筛选和PCR鉴定,最终得到敲除genQ基因工程菌GQ175。经摇瓶发酵,生物效价达728μ/ml,与出发菌G1008的产抗能力相当。TLC和MS分析结果显示,GQ175的庆大霉素生物合成代谢流被阻断,只积累中间物质G418,表明genQ参与了C-6’氨基化修饰作用。根据同源性分析,可以确定genQ负责C-6’的脱氢作用。同时,获得了G418单组分产生菌GQ175,申请了国家发明专利。基因genB2功能的研究：采用与研究基因genQ相同的方法和出发菌,构建重组质粒pZB303,敲除genB2基因得到工程菌GB102。GB102摇瓶发酵单位为856μ/ml,且色素含量少。代谢产物经TLC、HPLC和MS检测分析,GB102的庆大霉素代谢流发生了改变,主要积累庆大霉素C2a；此外,还有少量庆大霉素C1a和C1。证明genB2负责庆大霉素C2a C-6’的差向异构化。基因genD2功能的研究：采用与genB2相同的研究方法和出发菌株,构建质粒pDB303,敲除genD2基因得到工程菌GD238,摇瓶发酵单位为100μ/ml左右。经MS检测结果表明,GD238不再合成庆大霉素C族组分,只积累庆大霉素A2和A2e。结合文献有关生物信息学的报道,确定genD2是负责C-3"位点的脱氢作用。并推测A2被甲基化酶GenK进一步修饰成A2e。在中国药科大学学报上发表论文。庆大霉素A2e合成基因的研究。采用相同的研究方法,以工程菌GD238为出发菌株,借助genK敲质粒pFD308,得到进一步敲除genK工程菌GDK3。其代谢产物经MS分析,只积累庆大霉素A2,没有A2e,证明GenK不但可以催化庆大霉素X2甲基化生成G418,也可以催化A2甲基化生成A2e。虽然催化位点与功能一样,但对催化底物的专一性要求不高。