目的:肝脏为人体最大的实质性器官,也是最为重要的器官之一,承担着机体重要的生物化学物质合成、代谢、解毒等功能。同时,肝脏比较脆弱,容易受到毒物、药物以及有毒代谢产物等各种因素的损害。近年来,随着人民生活压力的加大,生存环境遭到污染,食品药品安全事故频发,与肝功能损伤相关的疾病的发病率呈逐年上升的趋势。因此,防治肝功能损伤显得极为迫切,也是当前研究热点。中药具有多靶点、副作用少、疗效好等治疗特点,因此使用中药防治肝功能损伤越来越受到国内外学者的重视。虎杖为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根茎和根,具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰等功效。虎杖苷(polydatin,PD)为其指标性成分,又名白藜芦醇苷。现代药理学研究表明,PD具有保肝、抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡等多种作用。本实验拟先通过体外抗氧化评价方法测定PD的体外抗氧化活性,再通过D-半乳糖(D-gal)致肝损伤模型和酒精肝损伤模型来研究PD对肝损伤的干预作用及其机制。方法:1.PD体外抗氧化活性的测定测定PD对DPPH、ABTS、·O2-、·OH自由基的清除能力,综合评价PD的体外抗氧化能力。2.PD对D-gal所致的肝损伤的保护作用及其机制将昆明小鼠随机分为6组,每组10只,分别为正常组(Vehicle),模型组(D-gal,200 mg/kg),阳性药物VE组(VE,200 mg/kg),PD低中高三个剂量组(50、100和200mg/kg)。除正常组外,其余各组小鼠每天下午颈背部皮下注射D-gal,正常组注射相同体积的生理盐水。同时,除正常组和模型组灌胃生理盐水外,其余各组灌胃相应的药物。造模给药8周,每天观察小鼠一般形态特征,例如饮食,体重增长,精神状态,毛发,行为活动等。末次造模给药24 h后,摘眼球取血,解剖取各个脏器(脾脏、胸腺、肾脏)并测量其脏器指数。从每只小鼠的相同部位取一定量的肝组织,多聚甲醛固定,H&E染色方评价肝组织病理结构变化;离心分离血清,用全自动生化检测仪测定血清中ALT和AST的含量;运用ELISA技术分析血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平;取肝组织制备成肝匀浆后,生化定量法分析小鼠肝组织匀浆中T-AOC能力,SOD、CAT、GSH-PX、MDA的含量。利用Western-blot技术分析检测Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达以进一步探讨PD对D-gal所致的肝损伤的保护作用机制。3.PD对酒精所致的肝损伤的保护作用及其机制60只健康雄性SD大鼠随机分为6组:正常组(Vehicle),模型组(Model),阳性药物水飞蓟素组(Sily),PD低中高三个剂量组(25、50和100mg/kg),每组10只。除正常组和模型组灌胃给予生理盐水,其余各组大鼠预先灌胃给药7天,第8天开始,模型组和药物组通过灌胃给予56%的乙醇(7ml/kg)诱导酒精肝损伤模型,共造模5次,每次间隔12h。末次造模给药12h后腹主动脉取血,离心获得血清,用全自动生化检测仪测定血清中ALT、AST、ALP、LDH的含量;从每只小鼠的相同部位取一定量的肝组织,多聚甲醛固定,H&E染色方评价肝组织病理结构变化,油红O染色方评价肝脂肪变性的严重程度;运用ELISA技术分析血清中TNF-α、IL-13和IL-6的表达水平;取肝组织制备成肝匀浆后,生化定量法分析小鼠肝组织匀浆中TG、MDA、ROS、SOD、CAT、GSH-PX 的含量。利用 Western-blot 技术分析检测 CYP2E1、Nrf2、HO-1、TLR4、NF-κBp65的表达以进一步探讨PD对酒精所致的肝损伤的保护作用机制。结果:1.PD体外抗氧化活性的测定PD有很好的体外抗氧化活性,可有效清除DPPH、ABTS、·02-、·OH,IC50值分别为87 ±2.10 μg.mL-1,20 ± 1.30 μg.mL-1,125 ± 3.50 μg.m-181 ± 2.90 μg.mL-1。2.PD对D-gal所致的肝损伤的保护作用及其机制对各组小鼠的一般形态特征观察发现,模型组小鼠毛色暗淡,发黄,脱毛现象严重,体重瘦弱,精神萎靡,活动量减少。与模型组相比,PD各剂量组的体重,毛色,精神状态等都有不同程度的恢复。与模型组相比,PD中、高剂量组能明显缓解肝损伤模型小鼠脾脏、胸腺指数的下降(p<0.05),对肾脏指数的下降也有一定程度的缓解,但没有统计学意义(p>0.05)。小鼠连续八周颈背部皮下注射D-gal后,模型组小鼠血清中ALT、AST含量明显高于对照组,给予PD后,显著抑制了两者的升高。H&E结果表明,与正常组相比,模型组小鼠表现出肝细胞肿胀、坏死、炎性浸润等病理结构变化,PD各剂量组小鼠能够不同程度的减轻肝组织微观结构的病理变化。与模型组相比,PD各剂量组能够提高肝组织匀浆中T-AOC水平及CAT、GSH-Px、SOD活性,降低MDA的含量;降低TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量;Western-blot结果显示,PD能够上调与细胞凋亡有关的蛋白Bcl-2的表达,下调Bax和Caspase-3的表达。3.PD对酒精所致的肝损伤的保护作用及其机制肝功能指标分析表明,PD各剂量组能显著降低酒精性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、ALP、LDH水平,并且H&E染色结果发现肝脏组织出现炎性浸润,肝实质性坏死,肝细胞索紊乱;油红O染色结果发现模型组大鼠肝组织细胞细胞质内出现大量脂肪滴,而口服灌胃PD则该类现象明显改善。与模型组相比较,PD各剂量组能够降低肝组织匀浆中TG、MDA、ROS的含量,而SOD、CAT、GSH-PX的含量则有不同程度的升高。CYP2E1、Nrf2/OH-1蛋白与氧化应激的形成关系密切,PD能通过下调CYP2E1蛋白的表达,上调Nrf2/OH-1蛋白的表达降低肝组织氧化应激水平。PD能显著降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平,且能下调与炎症反应有关的TLR4/NF-κB蛋白的表达。结论:体外抗氧化能力测试证实了 PD具有良好的体外抗氧化能力;D-gal致肝损伤模型说明了 PD具有一定的抗D-gal致肝损伤的作用,其作用机制可能与提高机体的抗氧化能力,抑制炎症反应和抑制肝细胞凋亡有关;另外,采用经典的酒精致肝损伤模型,证实了预先给予大鼠一定量的PD可以缓解酒精对肝脏的损害,其作用机制可能是通过调节CYP2E1、Nrf2/OH-1和TLR4/NF-KB等通路来降低机体的氧化应激水平和炎症反应来实现的。