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光动力治疗(Photodynamic Therapy,PDT)是现在临床实践中用于治疗肿瘤的一种微创治疗手段,如今已应用于皮肤肿瘤和皮肤癌前病变、头颈部肿瘤、颅内肿瘤、呼吸系统肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、妇科肿瘤中。它具有特异性好、创伤小、保护正常组织、重复性好的优势。但也存在光波穿透力弱,对较大肿瘤组织治疗不彻底,容易复发的不足。艾拉(5-ALA)是原卟啉Ⅸ的前体,属第二代光敏剂,相比其他光敏剂具有化学性质稳定、光动力效应强的优势。维生素D3是D族维生素中活性最强的一种,广泛分布于人体内,它对机体的钙磷代谢起着重要的作用。研究显示维生素D3除了能在体内调节钙磷代谢外,还能抑制肿瘤生长、促进肿瘤的凋亡、诱导肿瘤分化、调节免疫功能、增强肿瘤组织对放疗、化疗的敏感性。近期研究显示维生素D3能在体外增强血卟啉为光敏剂的光动力疗效。为了研究维生素D3是否能在体内及体外都能增强艾拉(5-ALA)作为光敏剂的光动力疗效,我们对SK-BR-3和MCF-7这两株人源乳腺癌细胞株在体内及体外使用了艾拉(5-ALA)作为光敏剂的光动力治疗,并联合运用维生素D3,观察维生素D3是否能增强光动力治疗疗效。在体外实验中,我们通过设立不同浓度梯度的维生素D3获得了进行下步实验的最适维生素D3浓度。我们通过MTT法测量各组OD值,然后计算各组细胞生长抑制率,发现维生素D3联合光动力(光动力治疗+维生素D3组)可以较单纯光动力治疗(光动力治疗组)显著增强其细胞抑制率(SK-BR-3细胞增殖抑制率75.82%±0.74 vs.47.04%±1.86,MCF-7细胞增殖抑制率 88.61±5.14vs.76.76±3.18);为了寻找维生素D3增强光动力对肿瘤细胞生长抑制的原因,我们通过ROS检测试剂盒和多功能酶标仪检测细胞内的ROS,证明维生素D3可以增加细胞内的活性氧的含量(ROS)。我们接着通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,发现维生素D3联合光动力(光动力治疗+维生素D3组)可以较单纯光动力治疗(光动力治疗组)显著增强细胞凋亡率(SK-BR-3细胞凋亡率38.13%±2.15 vs.18.20%±2.07,MCF-7 细胞凋亡率 63.14%±3.55 vs.30.53%±6.30);为检测细胞内原卟啉]X浓度,我们将两株细胞分别用艾拉(5-ALA)和艾拉(5-ALA)+维生素D3孵育24h,再用多功能酶标仪检测各组细胞的荧光强度,结果显示艾拉+维生素D3(5-ALA+D3)组细胞荧光强度要显著强于艾拉(5-ALA)组(SK-BR-3细胞荧光强度 193.80±15.18 vs.114.80±21.31,MCF-7 细胞荧光强度 299.10 ±20.76 vs.118.50±16.70)证明维生素D3可以增加细胞内原卟啉Ⅸ浓度。为寻找原卟啉Ⅸ浓度增加的原因,我们通过RT-PCR法检测了 CPOX(粪卟啉原氧化酶)、PBGD(卟啉原脱氨酶)、UROS(尿卟啉原合成酶)、FECH(铁螯合酶)的mRNA表达情况,发现CPOXmRNA表达上调。证明维生素D3可以增加粪卟啉氧化酶原(CPOX)mRNA在细胞内的表达,细胞将5-ALA转化为原卟啉Ⅸ的能力提高,使细胞内原卟啉Ⅸ的浓度上升,光动力效应也随着增加,产生更多的活性氧(ROS)。最终增大对乳腺癌细胞株增殖的抑制,增加乳腺细胞凋亡,从而提高光动力治疗的疗效。在体内实验中,我们通过在裸鼠左侧乳腺处皮下成瘤,建立小鼠乳腺癌模型。给光动力治疗+D3组小鼠提前3天,每天按lug/kg体重予维生素D3腹腔注射,再将各组小鼠进行相应治疗处理,并进行观察。治疗后24小时从各组随机取一只小鼠治疗灶组织,取出组织立即固定,然后脱水、包埋、切片制成石蜡切片进行HE染色和免疫组化染色。肉眼观察可发现,光动力治疗+维生素D3组小鼠治疗灶黑色焦痂较单纯光动力治疗组黑色焦痂多,残余肿瘤组织少。HE染色显示,光动力治疗+维生素D3组可见大片细胞核碎裂、消失。单纯光动力治疗组HE染色显示,视野细胞多固缩,有少量细胞核碎裂。免疫组化染色显示,光动力治疗+维生素D3组较单纯光动力治疗组BAX染色深、VEGF-A染色浅。观察小鼠生存期发现,光动力+维生素D3组小鼠中位生存期为现24±4.38天,单纯光动力治疗组小鼠中位生存期为18±2.19天。结果显示,在使用艾拉(5-ALA)作为光敏剂的光动力治疗中,联合使用维生素D3可以增加光动力治疗对肿瘤组织的杀伤、增加肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤内血管组织的生成,并能延长小鼠生存期。我们的实验结果证明维生素D3可以通过上调乳腺癌细胞中CPOXmRNA表达,使细胞转化5-ALA的能力增强使细胞内原卟啉Ⅸ的浓度升高。当光照射肿瘤细胞,细胞内的原卟啉Ⅸ受激发产生更多的活性氧。活性氧与细胞内的生物大分子发生氧化反应和脂质氧化反应使肿瘤细胞功能受影响,导致肿瘤细胞凋亡、坏死,这包括了在小鼠体内实验中发现结合维生素D3的光动力治疗小鼠的肿瘤组织更多的发生凋亡、坏死,治疗后残留肿瘤组织更少。进一步研究发现,维生素D3结合光动力治疗小鼠组织内,BAX表达上调促进肿瘤组织凋亡,VEGF-A表达下调抑制肿瘤新生血管生成。最后通过对比小鼠生存时间发现,5-ALA为光敏剂的光动力治疗+维生素D3组小鼠较单纯光动力治疗小鼠获得了生存受益。我们的研究首次发现了在小鼠活体内光动力治疗+维生素D3较单纯光动力治疗增加了 BAX的表达,促进肿瘤组织凋亡;减少了 VEGF-A表达抑制了肿瘤组织内血管生成;并在这些因素多重影响下使光动力+维生素D3组小鼠获得生存获益。