神经胶质瘤是一种侵袭性极强的原发性肿瘤,不能通过手术完全切除,且后期放化疗的效果不佳,患者具有很高的复发率和死亡率。神经胶质瘤的病因以及发病机制十分复杂,对其深入研究具有重要的意义。研究表明,HCMV在神经胶质瘤的发生发展过程中起到十分关键的作用,HCMV基因及其产物在不同分级的神经胶质瘤组织中有不同程度的表达。另有研究结果支持,HCMV感染可以影响TOP2A m RNA和蛋白的表达量。TOP2A在DNA合成、转录和染色体分离中能够发挥主要作用,且在多种肿瘤中出现特异性高表达,从而引发肿瘤细胞的异常增殖、周期缩短、凋亡受阻。因此,多项研究中均表明:TOP2A可能是潜在的肿瘤治疗新靶点,并有望成为临床中抗肿瘤的新疗法。本研究通过对临床病理标本和患者临床资料进行分析,探讨神经胶质瘤中HCMV感染与TOP2A的表达及患者预后之间的关系;再通过CCK-8分析检测细胞的增殖情况、TUNEL凋亡实验检测细胞的凋亡情况、Transwell实验检测细胞的侵袭情况、划痕实验检测细胞的迁移情况,探究TOP2A在神经胶质瘤发生发展过程中对生理学功能的影响。为更进一步阐明TOP2A在临床中可成为潜在的靶基因,通过靶基因预测网站Taget Scan7.1对可能与TOP2A相结合的mi RNA进行预测,结果表明TOP2A能够直接与mi R-144-3p结合,并通过分子生物学方法(双荧光素酶报告基因检测)验证TOP2A和mi R-144-3p之间是否存在结合能力;最后分别验证mi R-144-3p对细胞增殖、细胞侵袭能力、细胞单克隆形成能力以及裸鼠体内成瘤能力的作用。本文拟以TOP2A作为研究的切入点,研究HCMV在感染过程中,TOP2A与mi RNA-144-3p的表达情况和结合能力,以及在肿瘤恶性程度的变化过程中两者起到的作用,进而从新的角度探讨神经胶质瘤发生发展的机制。目的:1.通过检测HCMV阴性和阳性的神经胶质瘤临床标本以及神经胶质瘤细胞系中TOP2A的表达量情况,探究在胶质瘤中HCMV阴阳性和TOP2A表达量之间所存在的关系。并分析患者临床资料中TOP2A表达水平与患者的性别、年龄、WHO分级、KPS评分,以及患者术后总生存率、术后无瘤生存率之间存在的关系。2.HCMV感染神经胶质瘤细胞系U87和U251后,通过检测IE1和TOP2A的表达量情况,探究HCMV IE1与TOP2A表达量之间存在的关系。3.分别在神经胶质瘤细胞系U87、U251细胞中转染TOP2A-specific small interfering RNAs(si TOP2A)和corresponding control si RNA(si NC)后,检测各组细胞增殖、细胞凋亡、细胞侵袭、细胞迁移的情况。从而研究HCMV是否能够通过影响TOP2A表达,继而参与神经胶质瘤的发生发展。4.运用生物信息学的方法预测与TOP2A相结合的mi RNA,并通过分子生物学方法(双荧光素酶报告基因检测)对mi R-144-3p是否可以直接靶向TOP2A 3’-UTR进行鉴定。5.对神经胶质瘤临床标本和神经胶质瘤细胞系U87和U251细胞进行分析,将临床样本和胶质瘤细胞系分为HCMV阴性和阳性两组,分别检测各组的mi R-144-3p表达情况,并进一步分析TOP2A与mi R-144-3p表达量之间存在的关系。6.将mi R-144-3p mimics和control mi RNA(mi RNA-con)分别转染至神经胶质瘤细胞系中,通过分别检测各组细胞的细胞增殖情况、细胞侵袭情况、细胞单克隆形成情况以及裸鼠体内成瘤能力,从而研究mi R-144-3p在HCMV感染的神经胶质瘤中所能发挥的具体作用机制。方法:1.将收集的神经胶质瘤组织样本进行免疫组化和q PCR分析,检测胶质瘤样本中HCMV的阴阳性,由此将临床样本分为HCMV阳性和HCMV阴性两组。将分组后的样本进行q PCR分析,分别检测两组中TOP2A m RNA的表达量情况;采用Western-blot分析,检测HCMV感染和未感染的神经胶质瘤细胞中TOP2A的表达量。分析患者临床资料中TOP2A表达水平与患者的性别、年龄、WHO分级、KPS评分以及患者术后总生存率、术后无瘤生存率的相关性。统计并分析HCMV感染与TOP2A表达及患者预后的相关性。2.q PCR检测HCMV感染后神经胶质瘤细胞系U87和U251中IE1和TOP2A的m RNA表达水平;Western-blot检测HCMV感染后神经胶质瘤细胞系U87和U251中IE1和TOP2A蛋白的表达水平。并对IE1和TOP2A表达量的相关性进行分析。3.将神经胶质瘤细胞系转染si TOP2A和si NC后,48 h后提取各组细胞的RNA和蛋白,用q PCR分析和Western-blot分析检测转染后神经胶质瘤细胞系U87与U251中TOP2A和IE1的表达量;用CCK-8分析检测神经胶质瘤细胞系U87与U251的细胞活力;用TUNEL试剂盒验证细胞凋亡的情况;用Transwell实验验证细胞侵袭的情况;用划痕实验验证细胞迁移的情况。4.通过生物信息学手段(Target Scan7.1生物信息预测网站)查找能够与TOP2A结合的mi RNA,并通过分子生物学的手段(双荧光素酶报告基因检测)证明是否TOP2A与mi R-144-3p两者之间存在着直接结合的可能性。5.q PCR检测40例神经胶质瘤临床标本和神经胶质瘤细胞系U87和U251中HCMV阴阳性与mi R-144-3p表达之间的关系,并分析TOP2A和mi R-144-3p之间表达量的关系。6.将mi R-144-3p mimic及control mi RNA转染至神经胶质瘤细胞系U87和U251,并别检测各组细胞活性、细胞侵袭能力、细胞单克隆形成能力以及裸鼠体内成瘤能力。结果:1.将收集的神经胶质瘤组织样本进行免疫组化和q PCR分析,结果表明:在40例临床样本中,HCMV阳性共有29例,HCMV阴性共有11例。根据q PCR检测结果发现:HCMV阳性的样本中TOP2A m RNA和蛋白的表达明显高于HCMV阴性组,结果具有统计学意义(P<0.01)。为使结果更为可信,我们对胶质瘤细胞系同样进行了检测。HCMV分别感染神经胶质瘤细胞系U87、U251后,检测细胞中TOP2A的m RNA和蛋白相对表达量,结果显示:TOP2A的表达量明显上调(P<0.01);而在未感染的对照组中,TOP2A的相对表达量未见有明显变化。根据TOP2A的表达量情况计算中位数后,以中位数为标准将40例神经胶质瘤样本分为TOP2A高表达组和TOP2A低表达组,并统计和分析TOP2A表达水平与患者的性别、年龄、WHO分级、KPS评分之间的相关性。结果显示:TOP2A表达水平与患者年龄、性别和KPS评分没有显著的相关性(P>0.05);但TOP2A表达量和胶质瘤的WHO分级具有明显的相关性,为呈负相关(P<0.05)。统计各个患者术后的总生存率以及术后无瘤生存率,根据统计结果显示:在TOP2A高表达组的患者中,患者术后的总生存率和术后无瘤生存率较TOP2A低表达组的患者明显降低,结果具有统计学意义(P<0.01)。2.HCMV感染神经胶质瘤细胞后,在不同的时间点对TOP2A的m RNA和蛋白表达量进行检测,结果发现:HCMV感染后,其表达水平均有明显的升高,且在感染的48h后升高显著(P<0.01)。将HCMV感染和未感染的神经胶质瘤细胞系U87、U251分别转染si TOP2A和si NC,用q PCR分析和Western-blot分析检测转染后U87细胞和U251细胞中TOP2A和IE1的表达量,结果显示:TOP2A低表达可降低IE1的表达量(P<0.01)。3.转染TOP2A si RNA和si NC神经胶质瘤细胞系后,用CCK-8分析细胞的活力,结果表明:si TOP2A具有抑制神经胶质瘤细胞增长的能力(P<0.01);用TUNEL检测细胞的凋亡情况,结果表明:si TOP2A可促进神经胶质瘤细胞的凋亡(P<0.01);用Transwell实验检测细胞的侵袭情况,结果表明:si TOP2A可抑制神经胶质瘤细胞的侵袭(P<0.01);用划痕实验检测细胞的迁移情况,结果表明:si TOP2A可抑制神经胶质瘤细胞的迁移(P<0.01)。4.用生物信息学分析预测TOP2A可与mi R-144-3p结合,并通过分子生物学方法进一步验证,结果显示:mi R-144-3p能够直接靶向TOP2A。5.用q PCR方法检测40例临床样本中mi R-144-3p的表达量,结果显示:在HCMV阳性组的样本中,mi R-144-3p的表达量明显低于HCMV阴性组。为进一步证明结果的可靠性,在神经胶质瘤细胞系U87和U251中转染mi R-144-3p mimics和mi R-con后,分别检测各组细胞中mi R-144-3p和TOP2A的表达情况。结果显示:TOP2A和mi R-144-3p之间表达量的关系呈负相关(P<0.01),其结果与体外细胞实验结果一致。6.将mi R-144-3p mimics和mi RNA-con分别转染神经胶质瘤细胞U87和U251后,检测细胞的生物学功能。细胞增殖结果显示:mi R-144-3p高表达对细胞的增殖具有抑制能力。并建立裸鼠模型,将mi R-144-3p mimics和mi RNA-con转染后的U87细胞注射到裸鼠皮下,每周测量各组肿瘤,mi R-144-3p可以抑制肿瘤的生长,结果具有统计学意义(P<0.05);4周后处死并解剖小鼠,比较各组中肿瘤的重量,结果表明:mi R-144-3p可以显著降低体内肿瘤的形成能力(P<0.01)。划痕实验的结果显示:mi R-144-3p高表达对细胞侵袭具有抑制作用(P<0.01)。细胞单克隆形成实验结果表明:mi R-144-3p高表达对细胞的单克隆形成能力具抑制作用(P<0.01)。