论文部分内容阅读
葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌是许多单子叶、双子叶和裸子植物上常见的病原菌、内生菌和腐生菌。能引起许多多年生木本植物产生溃疡、枯萎、坏死和流胶等症状。桃(Prunus persica L.)流胶病过去多认为是逆境和管理粗放等引起的生理性病害,而葡萄座腔菌属真菌在我国作为桃流胶病病原菌并没有进行系统的研究。桃流胶病主要为害枝干,造成主干、主枝等部位树皮产生胶状溢出物,树胶初期无色透明,随时间推移逐渐变成红褐色至深褐色。湖北省是我国重要的桃产区,流胶病发生严重,本研究从湖北省桃流胶病病原学入手,在分生孢子形态学、培养特性、分子系统学和致病性研究的基础上,对桃流胶病菌进行鉴定。同时,设计PCR特异性引物用于病原菌快速检测；对不同桃品种的抗病性进行评价等。主要结果如下：1.我国湖北省桃流胶病菌为Fusicoccum aesculi Corda, Diplodia seriata De Not.和Lasiodiplodia theobromae (Pat.) GrifF&Maubl.。Botryosphaeria spp作为桃流胶病菌最早是20世纪70年代在美国Georgia州报道的。到目前为止,我国报道的引起桃流胶病的该属真菌只有Botryosphaeria dothidea (Moug.) Ces.&De Not.。湖北省是我国桃生产的重要产区,流胶病发生普遍。为了解该省桃流胶病的发生情况,在咸宁市、武汉市、孝感市、随州市、远安县(宜昌市)等地调查了14个果园的1914棵桃树,总发病株率99.2%。从武汉市、咸宁市、孝感市、远安县(宜昌市)、随州市、老河口市(襄阳市)、沙洋县(荆门市)、公安县(荆州市)、枣阳市共采集桃流胶病枝条170份,获得116个Botryosphaeria spp分离株。结合菌落培养特性、分生孢子形态学、致病性测定和rDNA内转录间隔区(rDNAITS, ITS1-5.8S-ITS2)、β微管蛋白(p-tubulin)和α延伸因子(EF1-α)的分子系统学将湖北省桃流胶病菌鉴定为：F. aesculi(有性阶段B. dothidea)、D. seriata(有性阶段B. obtusa (Schwein.) Shoemaker)和L. theobromae(有性阶段B. rhodina (Cooke) Arx),其中F. aesculi分离频率最高,分布最广泛；L. theobromae仅在沙洋县发现；D. seriata在公安县有分布。人工菌丝块接种当年生新梢和多年生枝条结果表明,这三种真菌对桃树都有致病力,能产生褐色病斑；L. theobromae致病力最强,且能引起多年生枝条产生大量胶液；D. seriata致病力最弱。2.通过分生孢子形态学、致病力测定、分子系统学和微卫星分析证明了我国桃流胶病菌F. aesculi的遗传多样性。形态学研究表明,我国桃流胶病菌F. aesculi主要有两种类型的分生孢子,一种是典型的纺锤形至椭圆形、无色透明的无隔Fusicoccum属分生孢子；另一种是纺锤形的一分隔分生孢子,并不是很常见。致病力试验中,18个F. aesculi分离株接种曙光油桃新梢5d时,病斑长度差异显著,最长达40.1mm(菌株XNHG-241),最短仅5.8mm (XNHG-62)。ITS、β-tubulin和EF1-α3个基因的分子系统学分析进一步证明了F. aesculi是我国最常见的桃流胶病菌,分布范围最广,存在种内分化现象。利用微卫星引物M13, T3B和(CTC)4RC获得了DNA指纹图谱,0-1矩阵在SAS8.1软件中Cluster(聚类)和建树(Tree)分析表明我国桃流胶病菌F. aesculi可以分为7类。第一类包括FH-11, MYA-6, HB-14, XG-52, WX-12, XX-25, SHYJ-1, CDA-20, CD-13, HB-11, YLA-6, WX-10, XX-1, WX11-12, SH-15, XX-23, FY-24, FY17, XX-44, JZ-7, GA-323, TA-44, JM-5, WH-1252等24个菌株；第二类包括CH-11, FYY-1, ZJG-42, FH-10, WX-3, JMA-1112等6个菌株；第三类包括菌株WH-1822；第四类包括菌株TA-1；第五类包括菌株JM-20；第六类包括菌株CSJ-10；第七类包括菌株SH-5。3.设计了桃流胶病F. aesculi的特异性引物。在β-tubulin基因序列区域设计了一个正向引物FaF,与非特异性反向引物Bt2b组成引物对,特异性的扩增桃流胶病菌F. aesculi基因组DNA,得到一条大小为322bp条带。参与检测的20个F. aesculi都能扩增出该条带,其它两种桃流胶病菌L. theobromae和D. seriata及桃树和其它植物上的其它属真菌显示为阴性。引物对FaF/Bt2b的灵敏度为浓度1pg/μl的基因组DNA。同时利用裂解法快速提取F. aesculi DNA用于PCR检测。结果表明,建立的桃流胶病菌分子检测方法可用于该病菌的分子检测,快速确定病原菌,及侵染源数量和病害流行的预测。4.结合田间调查和室内接种方法评价了不同桃品种对流胶病的抗病性。修订了桃流胶病病害分级标准,重新评价了7个桃园中的4个桃品种的发病严重程度。结果表明,同一果园病情指数比用旧标准调查的更低,如华中农业大学花果山中砂子早生、曙光油桃和早露蟠三个品种用旧标准调查的病情指数分别为84.0、94、82.8,而修定后调查的病情指数分别为52.1、61.7、43.4,更好地反映了田间发病情况；同一果园不同品种发病严重程度不同,感病性强弱结果为：曙光(油桃)>砂子早生(普通桃)>早露蟠(蟠桃)。同时,采用F. aesculi (菌株XNHG-241)室内人工接种了21个桃品种,所有品种均能发病；比较接种5d时病斑长度,发现曙光油桃最感病,早凤王最耐病。其中感病性曙光油桃>砂子早生>早露蟠,与田间调查结果一致。