轮状病毒（Rotavirus,RV）是引起婴幼儿急性胃肠炎的主要病原体。全球每年约有20万婴幼儿感染RV后因重症死亡。RV感染导致的疾病已成为严重的公共卫生问题,且给家庭及社会带来了疾病经济负担。至今没有特效药物治疗RV感叹引起的急性胃肠炎。现使用的疫苗证明可以预防RV感染,降低重症病死率。RV有多个血清型及亚组,依据其组抗原目前至少发现A-G七个亚组,其中A组是引起人类感染致病的主要组,同时根据RV结构蛋白VP7（糖基化蛋白,G）及VP4（蛋白水解酶敏感蛋白,P）又可分为多个G与P型。G1、G2、G4、G9,P[2]、P[4]、P[8]是主要流行株。目前使用的疫苗及研究中的疫苗也主要是针对这些型别。疫苗开发中的关键问题之一,是如何鉴别疫苗的型别:G型或P型。由于RV血清型间存在交叉反应,故使用多克隆抗体不能鉴别。单克隆抗体可针对病原体的某个成分,甚至是抗原表位发挥其高度特异性鉴别作用。本课题旨在利用杂交瘤技术制备G或P型单克隆抗体以期用于疫苗研发中的型间鉴别,同时也可用于RV病原学、流行病学中病原体的G、P定型。本课题利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,用A组轮状病毒ZTR-68株的全病毒超滤液腹腔注射免疫BALB/c小鼠,一个免疫周期结束后采血通过ELISA双抗体夹心法测定血清效价,利用PEG4000进行细胞融合,用HAT选择培养基培养10-12天后进行阳性杂交瘤筛选,通过ELISA双抗体夹心法筛选结束后扩大培养及有限稀释,通过两轮有限稀释和三轮扩大培养选取几株阳性杂交瘤注入BALB/c小鼠腹腔后大量收集腹水。利用Pro-Sep G纯化试剂盒纯化腹水后得到单克隆抗体,通过单克隆抗体亚型鉴定、抗体浓度蛋白测定、纯度分析、Western-Blot进行单克隆抗体特异性分析。同时利用此单克隆抗体对多型多株的其他A组轮状病毒:SA11、ITO、Wa、Gottfried、UK、B223进行ELISA、IF、Western-Blot分析,鉴定单克隆抗体特异性。还利用此单克隆抗体与多克隆抗体进行ELISA、IF、Western-Blot比较,多角度对单克隆抗体的特异性进行分析与鉴定。本课题用ZTR-68株全病毒超滤液作为抗原免疫原性良好,免疫效价能达到1:200000。利用杂交瘤技术制备筛选出两株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞:5H4B3-G6和5H4B7-G2,同时制备了高效价腹水进行纯化,并用腹水进行了后续鉴定实验。通过单克隆抗体亚型鉴定确定单克隆抗体为Ig M亚型,轻链类型为Kappa。抗体蛋白浓度分别为141.9μg/m L及176.2μg/m L。Western-Blot分析该单克隆抗体能够特异性识别A组轮状病毒,并提示该单克隆抗体能够识别轮状病毒VP4蛋白,通过与其他多型多株的A组轮状病毒的双抗体夹心ELISA表明,其中仅ZTR-68、Wa、ITO结果呈阳性,这三个毒株虽然G型不同,但拥有共同的P型:P[8]。IF结果与ELISA结果一致。Western-Blot分析表明,该单克隆抗体能够特异性识别A组轮状病毒。并且用多克隆抗体通过双抗体夹心ELISA表明ZTR-68、SA11、ITO、Wa、Gottfried、UK、B223结果均呈阳性,IF结果与ELISA结果一致。Western-Blot结果表明,多克隆抗体亦能特异性识别A组轮状病毒。用单克隆抗体与多克隆抗体比较可知,单克隆抗体的识别特异性优于多克隆抗体。本课题利用杂交瘤技术,经ELISA、IF证明获得了一株针对RV G1P[8]（ZTR-68株）的P[8]型单克隆抗体,该单克隆抗体可以鉴别不同的P型毒株。经六株不同G型和P型毒株比较表明,其特异性优于多克隆抗体。并且杂交瘤分泌型抗体效价水平低于多克隆抗体、腹水效价低于多克隆抗体。该单克隆抗体亚型分型为Ig M,轻链类型为Kappa。获得的该株分泌特异性抗体的杂交瘤细胞有用于疫苗的研发中。