保卫细胞和副卫细胞中水通道蛋白的动态特征

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气孔是水分和CO2出入的通道,在调控植物生长发育和响应外界环境胁迫的过程中发挥重要作用。拟南芥气孔的开闭受生物因素(如病原菌入侵)和非生物因素(如光照和干旱)的调节。在病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)中,鞭毛蛋白flg22可以诱导H2O2的产生,促进水通道蛋白对水分的运输,致使保卫细胞原生质体水势(pf)增加,诱导气孔关闭。因此,在气孔关闭过程中,水通道蛋白在保卫细胞和副卫细胞之间水分的运输中发挥着重要的作用。截至目前,人们对水通道蛋白的的功能进行了大量研究,然而,水通道蛋白向胞内或向胞外跨膜运输水分的过程中,蛋白的动力学特征及其调控机制尚不明确。本研究以模式植物拟南芥(生态型:Columbia-0)为研究材料,以AtPIP2;1蛋白(水通道蛋白)为研究对象,通过气孔开度测量发现,与WT(野生型)和35S::GFP-PIP2;1(超表达)相比,在flg22诱导气孔关闭过程中,pip2;1(突变体)的气孔关闭速率减缓。激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope,LSCM)观察发现,flg22诱导气孔关闭时,pip2;1质膜去极化减弱。通过荧光定量PCR和western blot检测发现,flg22处理后,AtPIP2;1的表达量与蛋白含量没有明显变化。通过激光共聚焦观察发现,AtPIP2;1蛋白发生明显的胞吞,表明flg22侵染拟南芥的早期阶段,可以引起AtPIP2;1的转运,进而调节气孔关闭。通过可变角度全内反射荧光显微镜(Variable-angle total internal reflection fluorescence microscope,VA-TIRFM)观察发现,GFP-AtPIP2;l 荧光蛋白在细胞质膜上呈不均匀的点状分布,存在高度异质性。单颗粒示踪(single particle tracking,SPT)分析显示:flg22处理后,保卫细胞中GFP-AtPIP2;1的扩散系数和扩散速率显著增加,停留时间变长;副卫细胞中GFP-AtPIP2;1的扩散系数和扩散速率降低,停留时间变短。破坏细胞骨架后,再加入flg22显示:与flg22单独处理相比较,GFP-AtPIP2;1的侧向运动加快,并且其在保卫细胞中的变化比副卫细胞的变化更加显著。Cellulase与flg22共同处理后,保卫细胞及副卫细胞中GFP-AtPIP2;1的侧向运动加快。在气孔关闭过程中,相比于细胞壁对运动的影响,微管骨架的破坏对GFP-AtPIP2;1蛋白运动的影响更加显著。综上所述,本研究采用细胞生物学方法,结合生化手段对拟南芥AtPIP2;1蛋白进行研究,结果表明:(1)水通道蛋白AtPIP2;1参与flg22调控的气孔关闭;(2)拟南芥胁迫早期阶段,AtPIP2;1通过胞吞作用改变质膜上AtPIP2;1的数量,调节气孔关闭;(3)细胞膜上AtPIP2;1蛋白的侧向运动同时受细胞骨架和细胞壁调控,且微管骨架对保卫细胞中AtPIP2;1蛋白运动的影响更为显著。这些结果揭示了不同类型细胞中水通道蛋白AtPIP2;1的动态特征和调控其动力学特征的关键因素,为进一步阐明不同类型细胞中,细胞膜蛋白的动态调控机制提供了理论参考。
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