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目的本研究采用慢性应激大鼠模型,从表观遗传学(DNA甲基化和组蛋白乙酰化)和细胞信号通路(PKA信号通路)的角度,探讨针刺对慢性应激模型(CUMS)大鼠行为学和脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白及基因表达的影响,为阐明针刺的抗抑郁作用机制提供一定的依据。方法1：40只雄性SD大鼠,体重(220～240)g,随机分为空白对照组(空白组)、模型组、模型+氟西汀组(氟西汀组)、模型+针刺组(针刺组)。除空白组,其余大鼠均接受28 d慢性温和不可预知刺激,氟西汀组在应激前30 min灌胃给药(1.8mg/kg/d),针刺组在应激前30 min针刺“百会”和“印堂”穴,每天一次。在实验第0d、7d、14d、21d、 28 d分别进行旷场、糖水实验,称取体重。实验结束后取海马组织和血清。ELISA法检测血清BDNF蛋白,RT-PCR法检测海马BDNF mRNA, Western-blot法检测海马BDNF、乙酰化组蛋白H3K9 (acH3K9)、脱乙酰化酶2(HDAC2)蛋白,甲基化PCR法检测海马BDNF基因启动子I甲基化。2：60只雄性SD大鼠,体重(220～240)g,随机分为空白对照组(空白组)、模型组、模型+氟西汀组(氟西汀组)、模型+针刺组(针刺组)、模型+氟西汀+H89组(氟西汀+H89组)、模型+针刺+H89组(针刺+H89组)。除空白组,其余大鼠均接受21d慢性温和不可预知刺激。针刺组和氟西汀组的造模和治疗干预方法同上。氟西汀+H89组和针刺+H89组在造模前1周进行侧脑室套管埋置手术,在应激前60 min给予侧脑室注射H89溶液(10μm,5μL),隔天一次。两个组在应激前30 min分别进行灌胃和针刺,每天一次。所有大鼠在实验第0d和第21d进行旷场、糖水实验,称取体重。实验结束后取海马组织。Western-blot法检测海马中蛋白激酶A (PKA)、 cAMP反应元件结合蛋白(CREB)和磷酸化CREB (p-CREB)的蛋白含量。结果1.针刺和氟西汀对模型大鼠行为学的影响实验前,各组大鼠行为学检测均无统计学差异(P>0.05)。造模后,与空白组相比,模型组的运动次数、糖水偏好百分比和体质量明显降低(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。与模型组相比,针刺和氟西汀均能提高模型大鼠的运动次数(P<0.05,P<0.05)、糖水偏好百分比(P<0.01,P<0.01)和体质量(P<0.05,P<0.01),但针刺与氟西汀对各项行为学的作用趋势不同。2.针刺和氟西汀对血清、海马中BDNF蛋白和海马BDNF mRNA的影响与空白组相比,模型组大鼠血清中和海马中BDNF蛋白含量均显著降低(P<0.01,P<0.01),海马中BDNF mRNA也明显降低(P<0.01)；与模型组相比,氟西汀能显著增加血清BDNF蛋白表达(P<0.01)和海马BDNF mRNA表达(P<0.01),针刺能显著增加血清和海马BDNF蛋白表达(P<0.01,P<0.01)和海马BDNF mRNA表达(P<0.01),但针刺增加血清BDNF蛋白和海马BDNF mRNA作用不如氟西汀(P<0.05,P<0.01)。3.血清BDNF蛋白、海马BDNF蛋白与行为学的相关性分析血清BDNF蛋白表达与海马BDNF蛋白表达存在正相关性(P<0.05)。旷场运动次数与血清BDNF蛋白存在正相关性(P<0.05),但糖水偏好百分比与血清BDNF蛋白相关性不显著(P>0.05)；海马BDNF蛋白与行为学(旷场运动次数、糖水偏好百分比)均存在正相关性(P<0.05,P<0.01)。4.海马BDNF蛋白、海马BDNF mRNA与行为学的相关性分析海马BDNF蛋白与海马BDNF mRNA相关性不显著(P>0.05)。但旷场运动次数和糖水偏好百分比与海马BDNF mRNA均有显著正相关性(P<0.000,P<0.005)。5.针刺和氟西汀对海马BDNF DNA启动子I甲基化的影响各组大鼠海马BDNF DNA启动子I甲基化差异均没有统计学意义(B 0.05)。6.针刺和氟西汀对海马acH3K9和HDAC2蛋白的影响与空白组相比,模型组海马内acH3K9蛋白含量明显降低(P<0.05)；与模型组相比,氟西汀组和针刺组的acH3K9蛋白含量均有上升趋势,但是没有统计学意义(P>0.05,P>0.05)。氟西汀组与针刺组相比差异也不显著(P>0.05)。与空白组相比,模型组海马内HDAC2蛋白含量显著升高(P<0.01)；与模型组相比,氟西汀和针刺均可降低海马内HDAC2的蛋白表达(P<0.01)。针刺组和氟西汀组之间的差异不显著(P>0.05)。7.海马acH3K9蛋白、HDAC2蛋白与BDNF mRNA的相关性分析海马acH3K9蛋白表达与海马HDAC2蛋白表达有显著的负相关性(P<0.005)。海马BDNF mRNA表达与海马acH3K9蛋白表达有一定的正相关性(P<0.05),与海马HDAC2蛋白表达有显著的负相关性(P<0.000)。8.海马acH3K9蛋白、HDAC2蛋白与行为学的相关性分析旷场运动次数与海马acH3K9蛋白表达有一定正相关性(P<0.05),与海马HDAC2蛋白表达有显著的负相关性(P<0.000)。糖水偏好百分比与海马acH3K9蛋白表达没有显著相关性(P>0.05),与海马HDAC2蛋白表达有显著的负相关性(P<0.000)。9.针刺和氟西汀对海马PKA-CREB信号通路的影响PKA特异性阻断剂H89能阻断氟西汀和针刺对模型大鼠行为学(水平穿越格数、竖立次数、糖水消耗量)的改善作用,且对氟西汀治疗作用的阻断更加显著。各组海马内CREB蛋白表达差异不显著(P>0.05)。与空白组相比,模型组海马内PKA-α和p-CREB蛋白表达明显降低(P<0.01,P<0.01)。与模型组相比,氟西汀组的PKA-α蛋白显著增高(P<0.05),p-CREB蛋白表达有上升趋势,但是没有统计学意义(P>0.05),针刺组的PKA-α和p-CREB蛋白表达均显著增高(P<0.01,P<0.05),氟西汀+H89组和针刺+H89组的PKA-α蛋白表达也增高(P<0.05,P<0.05)。与氟西汀组相比,针刺组的PKA-α和p-CREB蛋白表达均无显著差异(P>0.05,P>0.05),氟西汀+H89组的PKA-α蛋白表达无显著差异(P>0.05),但p-CREB蛋白表达显著下降(P<0.01)。与针刺组相比,针剌+H89组的PKA蛋白表达也无显著差异(P>0.05),但针刺+H89组的p-CREB蛋白含量显著降低(P<0.01)。结论1.慢性应激可以降低大鼠的自主探究行为,抑制奖赏系统和抑制体重增长。针刺能改善慢性应激诱导的抑郁样行为。2.慢性应激诱导的糖水偏好百分比和旷场运动次数下降与海马BDNF蛋白和BDNF mRNA含量降低有关,针刺可以通过提高海马BDNF蛋白和BDNF mRNA表达改善模型大鼠的抑郁样行为。3.慢性应激诱导的大鼠抑郁样行为及海马BDNF mRNA降低与海马内HDAC2蛋白含量增加有关,与组蛋白H3K9乙酰化(acH3K9)含量降低。针刺可以通过下调海马HDAC2蛋白表达,促进组蛋白H3K9乙酰化,增加BDNF mRNA表达,缓解模型大鼠的抑郁样行为。4.慢性应激诱导的大鼠抑郁样行为与海马内PKA信号通路受到抑制有关,针刺可通过激活海马内PKA信号通路发挥抗抑郁作用。5.海马内BDNF、 acH3K9、 HDAC2及PKA信号通路在抑郁症的病理生理学中均起重要作用,本研究证实针刺可以通过调节上述指标缓解模型大鼠的抑郁样行为,为阐明针刺的抗抑郁作用机制提供了科学依据。