前言动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的发生发展是一个极其复杂的多因素参与的动态病理过程,其缺血性并发症在大多数发达国家和部分发展中国家是主要的疾病和死亡原因,并且已逐渐成为全世界健康问题的焦点。众多传统的和非传统的心血管疾病危险因素所引起的血管内皮损伤是病变的始动阶段,由此产生的—系列级联反应,如单核细胞渗入血管壁、平滑肌细胞增殖,最终导致粥样斑块形成、不稳定斑块破裂以及一系列严重的缺血性临床并发症如急性冠状动脉综合症(acute coronary syndrome, ACS)的发生。因此如何保持血管内皮的完整性和功能活性对于延缓血栓形成、内膜增生等病变尤为重要,进而对于AS等心血管疾病的防治具有重要意义。由于成熟血管内皮细胞功能有限,因此,单纯依靠血管内皮细胞和血管生长因子不能及时有效地完成血管的再生修复,延缓病变的发展。近年来,大量的研究表明,骨髓源性／组织特异性内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)能够被动员,特异性归巢于血管内皮损伤部位,参与出生后血管动态维持和生理性重建,以其高增殖、分化潜能使血管内皮损伤后结构和功能的快速恢复成为可能。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)不但是一种炎性因子,还能刺激干细胞的增殖和分化。并且有研究表明,循环EPCs数量与血中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)水平呈正相关。PI3K/Akt信号转导途径是细胞内重要的信号通路,凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax、一氧化氮(nitric oxide, NO)都是其重要的下游因子。目前,关于GM-CSF对EPCs功能活性影响的研究较少,因此,本实验在体外分别分离培养大鼠骨髓和脾EPCs,来研究比较GM-CSF对两种来源EPCs功能活性的影响。另外,在体外分别分离培养大鼠骨髓EPCs和大鼠心脏微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells, CMECs),通过建立EPCs掺入CMECs的体外模型,从细胞、蛋白、基因水平来研究VEGF对EPCs功能活性的影响及其信号转导途径,从而为探讨血管再生修复机制及AS等缺血性疾病的防治提供理论依据和实验基础。一、GM-CSF对大鼠骨髓和脾内皮祖细胞功能活性的影响1、方法(1)EPCs的分离、培养、纯化及鉴定用密度梯度离心法分别分离培养大鼠骨髓和脾EPCs,用含低血清生长补充物(low serum growth supplement, LSGS)的M200培养液培养。24h后,将培养液倒入另一个培养瓶中继续培养。5d后首次换液,以后每2d换液一次。在倒置相差显微镜下观察EPCs的形态特征和生长分化过程。标记FITC-AC133和PE-vWF鉴定EPCs,在荧光显微镜下观察。选取培养7d的EPCs施加实验因素。(2)实验分组浓度效应组：对照组(无血清DMEM培养液),RatGM-CSF不同浓度组(25、50、100ng/ml),分别作用96h；相同浓度RatGM-CSF (100ng/ml)不同作用时间组(24、48、72、96h)。(3)EPCs增殖、迁移、管腔形成的检测分别用MTT比色法、Transwell小室、Matrigel管腔形成的体外模型检测RatGM-CSF对EPCs增殖、迁移、管腔形成的影响。(4)统计学分析各组实验重复三次,实验数据以x±s表示,用One-way ANOVA进行统计学分析。P<0.05有统计学意义。2、结果(1) EPCs的形态观察及鉴定培养5d可见多个贴壁的细胞集落形成,集落中央为圆形细胞,由中央向外周伸展出梭形细胞,与胚胎发生时期的血岛相似。培养7d时,中央的圆形细胞漂浮,外周的梭形细胞继续保持贴壁状态,生长旺盛。培养14d时,梭形细胞融合成内皮细胞单层。AC133阳性细胞被标记上绿色荧光,vWF阳性细胞被标记上红色荧光,双重染色阳性的细胞发黄色荧光,被认为是正在分化中的EPCs。(2) GM-CSF对EPCs增殖、迁移、管腔形成的影响与对照组相比,RatGM-CSF作用后,EPCs的OD490值、迁移的细胞数、形成的管腔数明显增加,并在一定范围内呈浓度及时间依赖效应。二、VEGF对大鼠骨髓内皮祖细胞功能活性的影响及其信号转导途径1、方法(1) EPCs的分离、培养、纯化及鉴定实验方法同论文一。(2) CMECs的分离、培养及鉴定用酶消化法分离大鼠CMECs,用含20%胎牛血清的DMEM培养液培养。在倒置相差显微镜下观察CMECs的形态特征和生长过程。用SP法对CMECs进行vWF免疫细胞化学鉴定,在光学显微镜下观察。(3)实验分组浓度效应组：对照组(无血清DMEM培养液),RatVEGF不同浓度组(10、25、50ng/ml),分别作用48h；相同浓度RatVEGF(50ng/ml)不同作用时间组(12、24、36、48h)。(4)建立EPCs掺入CMECs模型用2-(4-Amidinophenyl)-6 -indolecarba midinedihy drochloride (DAPI)标记EPCs,将EPCs和CMECs混合培养,用Matrigel建立管腔形成的体外模型。(5) EPCs增殖、迁移、管腔形成的检测分别用MTT比色法、Tanswell小室、Matrigel管腔形成的体外模型检测EPCs增殖、迁移、管腔形成能力。实验方法同论文一。(6) EPCs凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax、整合素β2、内源性VEGF表达的检测用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测EPCs凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax、整合素β2、内源性VEGF的表达。(7) VEGF对EPCs PI3K/Akt→eNOS/NO信号转导途径的检测①eNOSmRNA和eNOS蛋白表达的检测首先将EPCs分为对照组(无血清DMEM培养液)、RatVEGF组(50ng/m1)、RatVEGF (50ng/ml)+PI3K抑制剂LY294002 (50μM)组,分别作用1h和48h。然后分别用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)和Vestern blotting检测eNOSmRNA和eNOS蛋白的表达。②eNOS抑制剂对EPCs功能活性影响的检测首先将EPCs分为对照组(无血清DMEM培养液)、RatVEGF组(50ng/m1)、RatVEGF (50ng/ml) +eNOS抑制剂L-NAME (10μM)组,分别作用48h。然后分别用MTT比色法、Transwell小室、Matrigel管腔形成的体外模型检测EPCs的增殖、迁移、管腔形成能力。实验方法同论文一。(8)统计学分析各组实验重复三次,实验数据以x±s表示,用One-way ANOVA进行统计学分析。P<0.05有统计学意义。2、结果(1) CMECs的形态观察及鉴定CMECs大约在培养4h后贴壁。培养1d时,呈明显的短梭形。培养7d时,呈典型的“铺路石”样。vWF呈阳性表达。(2) VEGF对EPCs掺入CMECs的影响与对照组相比,RatVEGF显著增加EPCs掺入CMECs的数量,并在一定范围内呈浓度及时间依赖效应。(3) VEGF对EPCs增殖、迁移、管腔形成的影响与对照组相比,RatVEGF作用后,EPCs的OD490值、迁移的细胞数、形成的管腔数明显增加,并在一定范围内呈浓度及时间依赖效应。(4) VEGF对EPCs凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax、整合素β2、内源性VEGF表达的影响与对照组相比,RatVEGF显著上调凋亡相关蛋白Bcl-2、整合素p2、内源性VEGF的表达,下调凋亡相关蛋白Bax的表达,并在一定范围内呈浓度及时间依赖效应。(5) VEGF对EPCs PI3K/Akt→eNOS/NO信号转导途径的影响与对照组相比,RatVEGF组eNOSmRNA和eNOS蛋白的表达显著增强；当加入PI3K抑制剂LY294002后,与RatVEGF组相比,eNOSmRNA和eNOS蛋白的表达显著降低。PI3K抑制剂LY294002能够减弱RatVEGF所引起的eNOSmRNA和eNOS蛋白表达上调。(6) eNOS/NO信号转导途径与VEGF促进EPCs功能活性的关系与对照组相比,RatVEGF显著增强EPCs的增殖、迁移、管腔形成能力；当加入eNOS抑制剂L-NAME后，与RatVEGF组相比,EPCs的功能活性显著降低。eNOS抑制剂L-NAME能够减弱RatVEGF对EPCs增殖、迁移、管腔形成等功能活性的促进作用。结论1、GM-CSF能够显著增强体外培养的大鼠骨髓和脾EPCs的增殖、迁移、管腔形成能力,并在一定范围内呈浓度及时间依赖效应。2、VEGF能够显著增加体外培养的大鼠骨髓EPCs掺入CMECs的数量,并在一定范围内呈浓度及时间依赖效应。3、VEGF能够增强体外培养的大鼠骨髓EPCs的增殖、存活、迁移、管腔形成、粘附及合成分泌生长因子等功能活性,并在一定范围内呈浓度及时间依赖效应。4、VEGF对EPCs功能活性的影响可能是通过PI3K/Akt→eNOS/NO这一信号转导途径实现的。