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目的:构建并鉴定针对人Bcl-2基因的序列特异性短发夹样RNA(Shorthairpin RNA,shRNA)质粒载体并从中筛选出有效抑制序列。方法:根据Bcl-2基因序列及shRNA设计原则,化学合成4段编码短发夹RNA的寡核苷酸序列:shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4,设计一条乱序非编码片段shNC做为阴性对照,将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGPH1/GFP/Neo中H1启动子的下游,重组构建RNA干扰质粒,并对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。采用脂质体介导的转染方法将重组质粒转入SGC7901细胞后,荧光显微镜观察并测定转染效率,RT-PCR方法检测转染后Bcl-2 mRNA的表达,MTT法测定细胞增殖情况。结果:限制性内切酶PstⅠ和BamHⅠ酶切显示设计合成的shRNA编码序列被成功插入pGPH1/GFP/Neo质粒中,测序结果证实插入片断与设计序列完全一致。将shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4表达载体分别转染SGC7901细胞,转染效率达80%,转染后48、72小时RT-PCR测定4个实验组Bcl-2 mRNA表达水平均有降低,分别与shNC、脂质体组及未转染组比较,有显著性差异(P＜0.05),但转染shRNA2引起的Bcl-2 mRNA表达下降更为明显。MTT测定显示,与shNC、脂质体组及未转染组比较,转染Bcl-2 shRNA表达载体后,SGC7901细胞在48、72小时生长明显受抑,差异有显著性(P＜0.05)。结论:针对人Bcl-2基因的短发夹样RNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-Bc12shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4被成功构建,且均可不同程度特异性下调Bcl-2 mRNA表达并抑制SGC7901细胞的生长,其中以shRNA2的靶向抑制作用最强,从而为进一步稳定转染,进一步研究Bcl-2 shRNA对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响及研究Bcl-2基因功能奠定了基础。