猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种猪传染性呼吸道疾病，给世界养猪业造成了严重的经济损失。 通过对胸膜肺炎放线杆菌毒力因子的研究，发现胸膜肺炎放线杆菌三种外毒素(ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ)对于疾病临床症状的出现以及典型的肺部病变是必需的。这三种外毒素对宿主的肺泡巨噬细胞(AM)、多形核白细胞(PMNs)、肺上皮细胞和内皮细胞都有不同程度的细胞毒性，是该菌最重要的毒力因子。同时研究证实这三种外毒素也是其最重要的免疫原性因子。 这三种外毒素在体内和体外都能表达分泌。要产生和分泌具有生物活性的Apx毒素，需要有按一定顺序排列的四个基因CABD组成的操纵子来调控，其中A基因编码毒素结构蛋白，C基因编码毒素激活蛋白，负责对毒素进行酰基化激活，B基因和D基因的翻译后蛋白产物在细胞壁形成跨膜通道，负责毒素由细胞内到细胞外的分泌。各Apx蛋白的结构基因的表达产物没有毒性，需要apxC基因的表达产物激活后才能发挥其溶血活性和细胞毒性。本试验克隆三种毒素蛋白的A基因，研究其重组蛋白的毒性和免疫原性，为高效疫苗的研制提供试验依据。 在本实验室研究基础上开展了如下试验： 1．克隆表达胸膜肺炎放线杆菌三种主要毒素蛋白结构基因 在本实验室构建重组ApxⅠ的表达质粒pET-apxⅠA基础上，优化表达条件，进行了表达，表达产物以包涵体的形式存在。 参照胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡCA的序列(AY232288)和ApxⅢCABD的序列(L12145)，用PCR的方法克隆毒素Ⅱ的结构基因apxⅡA和毒素Ⅲ结构基因N端、C端片断。构建表达毒素Ⅱ的结构基因apxⅡA和毒素Ⅲ结构基因N端、C端片断的原核表达载体pET28aⅡA和pET-28aⅢN-C。并进行了表达，表达产物以包涵体的形式存在。 2．三种重组毒素蛋白分别对小鼠的毒性研究 为了验证三种重组蛋白是否有毒性，将试验分为ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ三个大组，各大组包括非复性重组蛋白组和复性重组蛋白组，以提取的天然毒素为阳性对照。以200μg／只的剂量腹腔注射小鼠，分别于24h、7day和14day后眼眶放血致死，并检测血常规和血液生化相关指标。结果表明，复性重组蛋白和非复性重组蛋白均不引起小鼠死亡，对小鼠的生长、血常规和血液生化指标影响较小。 3．重组毒素蛋白对小鼠的免疫保护性研究 在毒性试验研究的基础上，将试验分为ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ三个大组，各大