大肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，在癌症死亡谱中位居第三。尽管治疗措施不断改进，其整体治疗水平目前却仍然徘徊在70年代水平，术后5年生存率仍在50％～55％之间。治疗失败的主要原因是术后的局部复发和转移。肝脏是大肠肿瘤最常见、最容易发生的转移器官。大肠癌肝转移的发生率很高，有学者报告：在大肠癌初次确诊时，即有约20％—40％的病人同时存在有肝转移。大肠癌病例死亡后尸检时，肝转移可达36％—81％。这种高的发生率，可能是影响人肠肿瘤总的治疗水平的一个重要因素。 大肠癌肝转移的形成与大肠癌细胞本身的生物学特性、机体的免疫状况及肝脏的微环境有关。其形成过程可简单表示为：大肠癌原发灶—门静脉系血—肝脏—肝静脉入肺循环到全身(或入胆汁)。每个环节均受不同的基因调控，或被激活，或被抑制，相互协同或拮抗，最终影响肿瘤细胞的生物学特性。只有各方面条件都满足的情况下，癌细胞才能在肝脏形成转移灶。 综合文献报告，目前所知的肝转移相关基因和蛋白包括CEA，CD44，integrin，MMPs/TIMPs，SleX，nm23，DPC4，maspin等，但对大肠癌肝转移的相关分子机制研究目前尚不够明确。除类同其他肝转移的机制外，大肠癌肝转移中是否存在特异的分子事件以及特异的相关基因目前仍在进一步探索中。 如何从分子生物学角度来解释这一机制，探索大肠癌肝转移的分子事件，筛选相关的基因，为临床提供理论基础，从而为干预这一过程的发生发展提供有效的手段，是目前研究关注的热点，也是本课题研究的主要目的。 本课题采用Affymatrix基因芯片技术，对21对配对大肠癌、正常大肠粘膜、淋巴结及其肝转移组织标本的进行检测，从1.2万多个已知基因和EST中筛选出了在肝转移组织中高表达的基因—骨桥蛋白(osteopontin，OPN)。 浙 江 大 学 谆 士 研 兜 生 早 业 论 不 OPN是一种富含丝氨酸残基的磷酸化糖蛋白，其中含有特异的AFg－Gly－ASp序列 （RGD），这个序列是蛋白质分子中与细胞粘附有关的重要功能域［”1。OPN不仅与骨组织 的矿化密切相关，而且在许多非矿化组织中，如血管、内耳、肾、胆囊、胰腺、甚至在巨噬细胞和激活T淋巴细胞等中都发现了该蛋白的表达，还发现它与Ca’“、NO等细胞信使、 巨噬细胞趋化反应、平滑肌细胞增生及感染等多种生理、病理现象密切相关卜］。OPN与骨 组织的矿化、泌尿系结石的形成和动脉粥样硬化等生理、病理现象的相关性已得到大量文 献证实［””‘·”］，而 OPN与恶性肿瘤发生发展的关系特别是与肿瘤转移的相关性止日益引 起人们的关注l’‘］。但对OPN在大肠癌肝转移中的相关机制研究，国内外尚没有相关报道。 结合基因芯片的结果，为进一步验证和探索OPN与大肠癌及其肝转移的关系，开展了本课 题研究，以期发现和探讨OPN与大肠癌肝转移发生发展的内在联系，为临床预防和干预大 肠癌肝转移的发生发展提供有力的研究平台，并提供理论依据。 第一部分OPN基因工RNA表达差异研究 Nh 采用 RTPCR方法和实时荧光定量 PCR（real－time PCR）方法分别检测了人肠癌组织、 配对正常粘膜、肝转移组织、胃癌组织、乳癌组织、肝癌组织利外周血、不同人肠癌细胞 株中 OPN的 mRNA表达差异。检测结果发现：OPN mRNA在人肠癌肝转移组织中表达最 高，大肠癌原发组织次之，正常大肠粘膜表达最低；OPN mRNA的表达随大肠癌的 Dukes’ 分期增高而有增高趋势，和病理分化程度关系不明显；OPN mRNA在胄癌及肝癌组织中表 达均较周围工常组织增高，在配对乳腺癌组织中差异不明显；OPN mRNA ／f人肠癌患者外 周血中可见不同程度表达：OPN＊RN A在人肠癌细胞株C。1。205 中丫川性表达，而在 SW480大肠癌细胞株中表达阴性。 第H部分 OPN CDNA序列克隆及反义、正义OPN真核表达质粒的构建 为制备RNA原位杂交探针以检测OPN mRNA在不同组织中的定位，并为研究OPN 转移相关机制的细胞转染作准备，运川 RTPCR技术分别克隆了两种OPN cDNA序列：反 义序列（ZO帅）和O RFRF（974加），并由此构建了两种重组真核表达质粒：WDN A 3．1（q －OPN（20fop）反义真核表达质粒和 pCDNA3．l（＋）－OPN（ORF）正义真核表达质粒，为下一步 研究做好前期工作。酶切和测序结果均显示这两种重组质粒构建成功。 第三部分OPN在大肠癌及其肝转移组织中的觎NA及蛋白水平组织学定位 收集了有关肝转移资料进行原发病灶的构成分析，应用原位杂交方法检测了大肠癌及 其肝转移组织、正常肝组织中 OPN mguA的组织学定位，并应甩免疫组化方法检测了大肠 2 浙 江 大 学 俗 士 研 免 生 早 业 论 文癌及其肝转移组织、胃癌及其肝转移组织、正常肝组织中 OPN及其受体整合素a v和 CD44V6的蛋白表达，以探索O