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番茄是全世界栽培最为普遍的蔬菜之一。番茄黄萎病是由大丽轮枝菌造成的一种土传真菌性病害,其危害可大幅度降低番茄的品质和产量。目前,化学烟熏法虽然对防治番茄黄萎病有一定的作用,但会对公共健康及环境造成新的污染。培育的植物抗性新品种也常常被新出现的病原菌小种所克服。因此,通过研究大丽轮枝对番茄侵染,借助其诱导的番茄转录组测序分析,有助于发现番茄感病途径中早期启动的基因。一些感病关键基因的发掘,既可以为防治番茄黄萎病提供理论支撑,也为通过抑制感病途径来培育番茄抗病品种开拓新思路。 为此,本研究首先在无菌瓶内建立大丽轮枝菌侵染感病番茄品种Micro-Tom幼苗的亲和互作系统。然后,以大丽轮枝菌侵染番茄的根为材料,提取得到高质量的 RNA,反转为 cDNA后,利用新一代高通量 RNA测序(RNA-seq)技术得到未被侵染(对照)和被侵染(处理)48小时的番茄样品的转录组数据,然后通过比对分析,找到差异表达基因并进行功能注释分析。同时,利用 SMART技术构建了大丽轮枝菌酵母双杂交文库。主要实验结果如下: (1)在瓶内对大丽轮枝菌侵染番茄的表型与在培养皿中切茎段培养观察表明,在番茄被侵染第6天后5株番茄中1株番茄茎段形成菌落;到第14天5株番茄茎段培养有4个形成菌落,并且随着侵染时间的增加,植株表现萎焉、干枯等症状。表现出典型的黄萎病害特征,可以作为研究大丽轮枝菌和番茄亲和互作机制的简化了的模式系统。 (2)转录组测序对照和大丽轮枝菌侵染番茄根部48小时的材料发现,在2个样品中有1985个差异表达基因,其中有1307个上调和678个下调基因;通过搜索数据库比对显示,分别有1953、1579、1739、862和380个差异表达基因在 Nr、Swiss-Prot、GO、COG和 KEGG库中被诠释;选取 KEGG通路中感兴趣的2个途径——植病互作和植物激素信号转导途径,对其48个差异表达基因进行实时定量 PCR分析,筛选到 JAZ节点的2个感病候选基因(Solyc12g009220.1、Solyc07g042170.2)。 (3)利用 SMART技术,构建了大丽轮枝菌酵母双杂交 AD-cDNA文库。文库滴度为5.2×107 cfu/mL,文库库容为3.9×107 cfu,文库 cDNA插入片段长度主要分布在0.5-2 kb之间,平均为1 kb,重组率为96%。结果表明文库质量较好,可用于番茄与大丽轮枝菌互作蛋白基因的筛选。 综上所述,本研究构建了瓶内大丽轮枝菌侵染番茄亲和互作系统;并利用大丽轮枝菌侵染番茄根部材料的转录组测序和实时定量 PCR分析,发现了番茄感病调控网络中的2个候选差异表达基因;同时也建立了大丽轮枝菌酵母AD-cDNA文库,为筛选其互作基因提供了条件。上述研究为后续的功能验证感病关键基因,并最终诠释番茄与大丽轮枝菌亲和互作机理奠定了基础。