目的:多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)是一种以中枢神经系统(central nervous system,CNS)白质慢性炎症性脱髓鞘为病变特点的自身免疫性疾病,是导致青年人致残的神经系统疾病的重要病因。虽然MS的病因目前尚未完全明确,但是普遍认为MS是由遗传和环境因素下诱导的免疫稳态失调所导致的。MS的发病机制非常复杂,但是起关键作用的是对髓鞘成分的自身反应性CD4+T细胞所介导的免疫炎症损伤。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是被世界广泛认可的研究MS的动物模型。近期研究表明,腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子1(SIRT1)在调节免疫稳态和炎症反应方面发挥重要的作用。SIRT1为NAD+依赖的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶家族成员之一。AMPK是调控能量代谢的关键酶,活化后的形式为p-AMPK,并且具有SIRT1依赖的抗炎作用。本实验以NAD+作为干预药物,观察正常对照组(Control组)、EAE组、NAD+治疗组小鼠的临床症状、病理结果以及SIRT1、AMPK、p-AMPK的表达变化,探索NAD+对EAE发挥保护作用的可能机制。方法:1将24只雌性C57BL/6小鼠(周龄8-10周、体重18g-20g)随机分为正常对照组(Control组)、EAE模型组、NAD+治疗组,每组8只。以MOG35-55作为抗原,辅以结核菌素H37Ra、完全弗式佐剂、百日咳毒素建立EAE动物模型。自免疫第1天起(免疫当天为第0天),NAD+组小鼠每天腹腔注射NAD+250mg/Kg,Control组及EAE组小鼠每日腹腔注射等量的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS),同时,每天用Weaver法对小鼠进行两次神经功能评分,从免疫后第1天至30天,观察小鼠发病情况及病程。2将24只雌性C57BL/6小鼠(周龄在8-10周、体重18g-20g)随机分为正常对照组(Control组)、EAE模型组、NAD+治疗组,每组8只。以MOG35-55作为抗原建立EAE动物模型。自免疫第1天起(免疫当天为第0天),NAD+组小鼠每天腹腔注射NAD+250mg/Kg,Control组及EAE组小鼠每日腹腔注射等量的PBS,同时,每天对小鼠进行两次神经功能评分。于小鼠发病高峰期(免疫后第25天)留取标本,从Control组、EAE组、NAD+组各取3只小鼠,行灌注取材,留取脊髓腰膨大组织,进行HE染色,观察炎症细胞浸润程度;每组中另外5只小鼠,行新鲜取材,留取脾和脊髓组织,利用Western blot技术检测SIRT1、AMPK、p-AMPK蛋白的表达情况。3实验数据采用SPSS21.0软件进行统计分析,对实验数据进行正态性检验和方差齐性检验,计量资料以均数±标准差表示。发病率以百分比表示,用Fisher精确检验进行统计学分析。临床神经功能评分用Mann-Whitney U检验进行统计学分析。多组计量资料均数的比较:多样本之间比较满足正态性、方差齐采用完全随机设计的方差分析(ONE-WAY-ANOVA),组间比较应用SNK-q检验;非正态或方差不齐采用Kruskal-Wallis H检验。P<0.05具有统计学意义。结果:1各组小鼠病程比较:正常对照组小鼠未发病;和EAE组相比,NAD+组小鼠的发病率显著降低、发病时间被推迟、神经功能评分明显降低(P<0.05)。2 HE染色:在发病高峰期(免疫后第25天),与正常对照组相比,EAE组、NAD+组小鼠脊髓腰膨大组织中的炎性细胞浸润数明显增多(P<0.05);NAD+组与EAE组相比,小鼠脊髓腰膨大组织中的炎性细胞浸润数明显减少(P<0.05)。3 Western Blot(脊髓):在发病高峰期(免疫后第25天),EAE组小鼠较空白对照组相比,SIRT1、p-AMPK蛋白的表达水平下降(P<0.05);NAD+组小鼠较EAE组相比,SIRT1、p-AMPK蛋白的表达水平明显升高(P<0.05);空白对照组、EAE组、NAD+组相比,AMPK蛋白的表达水平无明显差异(P>0.05)。4 Western Blot(脾):在发病高峰期(免疫后第25天),EAE组小鼠较空白对照组相比,SIRT1、p-AMPK蛋白的表达水平下降(P<0.05);NAD+组小鼠较EAE组相比,SIRT1、p-AMPK蛋白的表达水平明显升高(P<0.05);空白对照组、EAE组、NAD+组相比,AMPK蛋白的表达水平无明显差异(P>0.05)。结论:1 NAD+可以降低实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的发病率,推迟EAE小鼠的发病时间,减轻EAE小鼠的临床症状,同时减轻EAE小鼠脊髓中的炎性细胞浸润程度。2 NAD+对EAE发挥保护作用的机制有可能是激活AMPK/SIRT1通路的结果。