神经病理性疼痛大鼠内质网分子伴侣BIP与Nav1.8蛋白相互作用的初步研究

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目的:鉴定慢性坐骨神经损伤(chronic constriction injury,CCI)模型大鼠中免疫球蛋白重链结合蛋白(heavy-chain immunoglobulin binding protein,BIP)与Nav1.8蛋白的相互作用。为进一步研究神经病理性疼痛(neuropathic pain,NP)中BIP与Nav1.8蛋白相互作用的位点,及BIP蛋白在神经损伤后Nav1.8表达与再分布中的作用机制奠定实验基础。方法:雄性SD(sprague dawley)大鼠220250g,24只,按随机数字表分为两组(n=12):模型组(CCI组)和假手术组(Sham组),每组12只,CCI组参照文献建立CCI模型,Sham组只暴露坐骨神经,不给予坐骨神经结扎。应用von Frey纤维丝和鼠尾光照测痛仪分别检测术前1 d和术后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d和14 d的机械缩足反应阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)和热辐射诱发甩尾潜伏期(tail flick latency,TFL)。于术后7 d和14 d检测完PWMT和TFL后取损伤侧L46背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)及坐骨神经组织,用于Western blot检测BIP与Nav1.8蛋白的表达;免疫荧光双重标记观察BIP与Nav1.8蛋白在细胞的共定位情况;免疫共沉淀鉴定BIP与Nav1.8蛋白的相互作用。结果:(1)Sham组术前1 d PWMT与术后1 d、3 d、5 d和7 d各时间点PWMT差异无统计学意义(P>0.05);术前1 d CCI组与Sham组PWMT差异无统计学意义(P>0.05);与术前1 d PWMT基础值比较,CCI组术后各时间点PWMT显著性降低(P<0.05),与Sham组比较,CCI组术后各时间点PWMT显著性降低(P<0.05)。(2)Sham组术前1 d TFL与术后1d、3 d、5 d、7 d、10 d和14 d各时间点TFL差异无统计学意义(P>0.05);术前1 d CCI组与Sham组TFL差异无统计学意义(P>0.05);与术前1 d TFL基础值比较,CCI组术后各时间点TFL显著性缩短(P<0.05),与Sham组比较,CCI组术后各时间点TFL显著性缩短(P<0.05)。(3)与Sham组比较,CCI组大鼠BIP蛋白在DRG上的表达显著性增加(P<0.05);与Sham组比较,CCI组大鼠Nav1.8蛋白在DRG上的表达显著性减少(P<0.05)。与Sham组比较,CCI组大鼠BIP蛋白在坐骨神经上的表达显著性增加(P<0.05);与Sham组比较,CCI组大鼠Nav1.8蛋白在坐骨神经上的表达显著性增加(P<0.05)。(4)BIP与Nav1.8蛋白在DRG上广泛分布,与Sham组比较,CCI组大鼠BIP蛋白在DRG上的荧光密度值显著性增加(P<0.05);CCI组与Sham组大鼠Nav1.8蛋白在DRG上的荧光密度值差异无统计学意义(P>0.05);同时,CCI组大鼠BIP与Nav1.8蛋白在DRG上存在共定位。BIP与Nav1.8蛋白在坐骨神经上广泛分布,与Sham组比较,CCI组大鼠BIP蛋白在坐骨神经上的荧光密度值显著性增加(P<0.05);与Sham组比较,CCI组大鼠Nav1.8蛋白在坐骨神经上的荧光密度值显著性增加(P<0.05);同时,CCI组大鼠BIP与Nav1.8在坐骨神经上存在明显的共定位。(5)BIP蛋白能够从CCI大鼠DRG中免疫共沉淀出Nav1.8蛋白,而阴性对照组IgG不能沉淀出Nav1.8蛋白;反之,Nav1.8蛋白也能免疫共沉淀出BIP蛋白,而阴性对照组IgG不能沉淀出BIP蛋白。结论:(1)CCI大鼠Nav1.8蛋白表达出现再分布,积聚在邻近损伤点的坐骨神经上;(2)CCI大鼠DRG及坐骨神经组织均发生ERS,使BIP蛋白表达增加;(3)CCI大鼠DRG中BIP与Nav1.8蛋白存在相互作用。
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