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第一部分Anti-TIM3以及MEK抑制剂对黑色素瘤免疫功能以及增殖凋亡的影响目的:评估抗T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(Anti-T cell immunoglobulin mucin-3,Anti-Tim3)和丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated ERK-regulating kinase,MEK)抑制剂在黑色素瘤中的抗肿瘤效果。方法:建立小鼠黑色素瘤模型后分组给药(第一组:Control;第二组:Anti-TIM3;第三组:MEK抑制剂GSK1120212组;第四组:Anti-TIM3+GSK1120212联合组)从小鼠黑色素瘤模型中提取单个核细胞(PBMC),利用流式细胞术检测各实验组小鼠PBMC中淋巴细胞亚群和IL-17a的数量变化,同时使用CCK-8,划痕实验检测各实验组对小鼠黑色素瘤细胞株B16F10增殖,迁徙的影响,评估MEK抑制剂多种给药途径产生的抗肿瘤效果。结果:流式检测结果显示Anti-Tim3组,GSK1120212组,Control组,GSK1120212+Anti-TIM3联合组CD8+(%)比例分别为(66±5(%);31±4.5(%);35±4(%);44±4(%)),IL-17a比例分别为(14.5±2.8(%);3±1.1(%);3.1±1.3(%);8.9±2.6(%)),提示Anti-Tim3与空白组相比可上调小鼠黑色素瘤PBMC中CD8+T细胞数量(***P<0.01,有显著性意义)以及IL-17a水平(*P<0.05,有显著性意义)。小鼠生存实验中GSK1120212组对小鼠黑素瘤体积的抑制率达到30%(***P<0.01;n=5,有显著性意义),而GSK1120212+Anti-TIM3联合组对小鼠黑素瘤体积的抑制率达到40.8%(***P<0.01;n=5,有显著性意义)。相比之下,Anti-TIM3组虽也对小鼠黑色素瘤发生发展起到了一定抑制作用(**P<0.01;n=5,有显著性意义),但是在肿瘤生长大小上的抑制效应并没有GSK1120212组以及GSK1120212+Anti-TIM3联合组来的明显。CCK-8,划痕实验显示,在GSK1120212以及联合组作用下的B16F10增殖,迁徙能力明显减弱,而Anti-TIM3组与Control组作用下细胞增殖,迁徙活力并无显著性差异。给药4h时,CCK-8结果显示,GSK1120212以及联合组对B16F10细胞株增殖活性的抑制达到了最高峰21%,24%(**P<0.01,有显著性意义),此后随着时间的推移,细胞增殖抑制能力依次递减,至36h时药物对B16F10增殖活力的抑制几乎完全消失。在比较GSK1120212不同给药途径抗肿瘤效果差异时发现,灌胃组与空白组相比较,其肿瘤大小的抑制效率大于30%(***P<0.01,有显著性意义),而皮下注射和腹腔注射两组抑制率约15%。结论:Anti-TIM3和MEK抑制剂在黑色素瘤的抗肿瘤效应中存在着协同作用。其中Anti-Tim3可恢复CD8+T细胞活性。MEK抑制剂促进黑色素瘤细胞凋亡并抑制其增殖,迁徙。提示Anti-TIM3和MEK抑制剂的抗肿瘤机制不同,但同时可能又存在着一定的关联。第二部分MEK下调对TIM3表达的影响目的:通过下调MEK表达探寻TIM3水平变化。方法:建立小鼠黑色素瘤模型后分组给药(第一组:Control;第二组:GSK1120212组)从小鼠黑色素瘤模型中提取PBMC,利用流式细胞术检测各实验组小鼠PBMC中各淋巴细胞亚群上TIM3水平变化,观察PMA刺激对体外人急性T淋巴细胞白血病(Jurkat)细胞表面TIM3表达的影响,同时通过Si-h-MEK2质粒电转染Jurkat T细胞来比较MEK2沉默与正常状态下TIM3的表达水平变化。结果:GSK1120212阻断小鼠黑色素瘤模型中MEK后,CD8+T细胞TIM3表达水平增高(GSK1120212组CD8+TIM3+比例17.6±2(%),对照组CD8+TIM3+比例5.95±3.7(%),**P<0.01,有显著性意义)。而CD4,NK表达TIM3水平与对照组相比并无显著性差异。Jurkat T细胞经过PMA刺激后活化,表达TIM3水平增高(*P<0.05,有显著性意义).RT-PCR和流式细胞术结果显示,在转染了Si-h-MEK2的Jurkat细胞中TIM3的m RNA和蛋白水平表达较对照组显著升高(流式结果显示,Si-h-MEK2组Jurkat T细胞TIM3+比例15.5±2.5(%),Control组TIM3+比例4.9±2.8(%),**P<0.01,有显著性意义)。结论:下调MEK可以促进TIM3的表达,从而影响了肿瘤微环境中免疫反应状态。