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第一部分Mindin在肾缺血再灌注损伤中的作用目的:探讨mindin基因敲除对小鼠肾缺血再灌注损伤的影响。方法:以蛋白质印迹法和免疫组织化学染色法检测C57BL/6小鼠在遭受双肾缺血30分钟再灌注24小时损伤后,肾脏mindin蛋白表达量的变化与组织分布。以野生型及mindin基因敲除小鼠建立肾缺血再灌注动物模型,检测小鼠血浆肌酐、尿素氮浓度以观察肾功能损害情况,以过碘酸雪夫染色检测肾脏组织病理结构的改变,并以急性肾小管坏死评分系统评估肾脏结构破坏程度。结果:实验结果显示假手术组小鼠肾脏mindin蛋白表达量较低,当遭受双肾缺血灌注损伤后,肾脏mindin蛋白水平显著升高,且蛋白主要分布于肾小管。此外,与野生型小鼠相比,缺血再灌注损伤后,mindin基因敲除小鼠的血浆肌酐、尿素氮浓度明显较低,肾小管结构破坏程度较轻,急性肾小管坏死评分较低。结论:肾缺血再灌注损伤能够诱导肾脏mindin蛋白水平升高,mindin基因敲除能够明显改善缺血再灌注损伤引起的肾脏功能及组织损伤。第二部分Mindin基因敲除减轻肾缺血再灌注损伤介导的炎症反应和细胞凋亡目的:在肾缺血再灌注损伤病理过程中,炎症反应和细胞凋亡介导了肾单位的破坏和肾功能的损害,本部分探讨mindin基因敲除对肾缺血再灌注损伤引起的炎症反应和细胞凋亡的影响以及潜在的分子机制。方法:以野生型及mindin基因敲除小鼠建立肾缺血再灌注动物模型,以苏木精/伊红染色法染色评估肾脏组织炎性细胞浸润水平,以免疫组织化学染色法检测肾脏组织中性粒细胞、巨噬细胞招募情况和炎性因子TNF-α、MCP-1表达情况,以TUNEL及cleaved-caspase3染色法评估各组小鼠肾脏组织细胞凋亡情况。此外,以蛋白质印迹法检测肾脏Toll样受体-4(TLR-4)、磷酸化JNK、JNK、磷酸化P65、P65、磷酸化IκBα、IκBα、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3表达水平。结果:双侧肾缺血再灌注损伤后,小鼠肾脏可观察到大量的炎性细胞浸润、炎性因子表达,同时缺血性损伤引起了外髓质区域细胞凋亡。但同野生型小鼠相比较,mindin基因的缺失显著改善了肾脏组织的炎性细胞募集和炎性因子产生,且细胞凋亡水平显著减轻。此外,蛋白质印迹法检测结果显示,肾缺血再灌注损伤引起肾脏组织TLR-4、磷酸化JNK、磷酸化P65、磷酸化IκBα、Bax、cleavedcaspase3表达水平明显升高,Bcl-2表达水平明显降低。但与野生型小鼠相比,在遭受肾缺血再灌注损伤后,mindin基因敲除小鼠肾脏TLR-4、磷酸化JNK、磷酸化P65、磷酸化IκBα、Bax、cleaved-caspase3表达水平较低,Bcl-2的表达较高。结论:Mindin基因敲除能够改善肾缺血再灌注引起的炎症应答及细胞凋亡,从而减轻肾损伤。其潜在机制可能为mindin基因敲除下调了TLR-4/JNK/NF-κB信号通路的激活,从而减轻损伤后炎症反应;而其抗凋亡作用可能与mindin基因敲除抑制了线粒体凋亡途径密切相关。第三部分过表达mindin加重缺氧/复氧介导的人肾小管上皮细胞凋亡和炎症信号通路激活目的:在体外水平,我们以人肾小管上皮细胞为研究对象,通过缺氧/复氧处理细胞,检测mindin蛋白表达量的改变,同时我们构建了mindin基因过表达稳转人肾小管上皮细胞系及空载对照细胞,以此探讨过表达mindin对缺氧/复氧损伤的影响及潜在机制。方法:正常人肾小管上皮细胞(HK-2)遭受24小时缺氧刺激后,以蛋白质印迹法及免疫荧光染色法分别于复氧后2小时、4小时、8小时评估mindin表达水平。同时我们以缺氧/复氧处理成功构建的mindin基因过表达稳转人肾小管上皮细胞系及空载对照细胞,以TUNEL、Hoechst33258染色评估损伤后凋亡程度,以ELISA检测TNF-α、MCP-1的分泌,以蛋白质印迹法检测细胞TLR-4、磷酸化JNK、JNK、磷酸化P65、P65、磷酸化IκBα、IκBα、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3表达水平。结果:本部分实验数据表明人肾小管上皮细胞mindin蛋白表达量较少,而缺氧/复氧处理能够诱导细胞mindin蛋白表达水平逐步升高,且于复氧后8小时升高最明显。TUNEL染色、Hoechst33258染色及ELISA检测发现,缺氧/复氧处理引起了明显的细胞凋亡和炎性介质产生,而与空载对照细胞相比,稳定过表达mindin促进了细胞凋亡和炎性介质分泌。此外,蛋白质印迹法检测结果显示,缺氧/复氧处理后,小管上皮细胞TLR4、磷酸化JNK、磷酸化P65、磷酸化IκBα、Bax、cleaved-caspase3表达量明显升高,Bcl-2表达量明显降低。而同空载对照细胞相比,缺氧/复氧处理后,过表达mindin显著提高了细胞TLR-4、磷酸化JNK、磷酸化P65、磷酸化IκBα、Bax、cleaved-caspase3表达水平,下调了Bcl-2的表达。结论:稳定过表达mindin能够促进缺氧/复氧介导的人肾小管上皮细胞线粒体途径凋亡;同时,过表达mindin促进了缺氧/复氧介导的炎性介质分泌和炎性信号通路TLR-4/JNK/NF-κB的激活。