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目的近年来胰腺癌的发病率在国内外均呈明显上升趋势,且预后极差,其五年生存率低于5%。即使术后辅助化疗的病人,5年生存期仍只有10%～30%。以吉西他滨为主的化疗方案是胰腺癌化疗的标准方案。而吉西他滨耐药仍然是延长患者总生存期(overall survival, OS)和无病生存期(disease free survival,DFS)的重要阻碍。因此,预测胰腺癌术后患者的化疗耐药性,从而选择最佳的化疗方案,实现更好的个体化治疗,对提高胰腺癌患者的生存具有重大意义。吉西他滨是一种很强的亲水性药物,不能以被动扩散的方式穿过细胞膜,而主要通过人平衡型核苷转运体1(human equilibrative nucleoside transporter-1, hENT-1)进入胞浆。在胞浆中,吉西他滨在被脱氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase,DCK)磷酸化成双氟脱氧胞苷一磷酸(difluorodeoxycytdine monophosphate, dFdCMP),随后,DCK将dFdCMP转换成其活性代谢物,即双氟脱氧胞苷二磷酸(difluorodeoxycytidine diphosphate, dFdCDP)及双氟脱氧胞苷三磷酸(difluorodeoxycytidine triphosphate, dFdCTP)。dFdCDP和dFdCTP通过抑制核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase, RR)来阻碍三磷酸脱氧核苷酸(deoxynucleotide triphosphates)的生成,而三磷酸脱氧核苷酸是合成DNA的必需材料。RR由其大亚基核苷酸还原酶M1(ribonucleoside reductase subunit M1,RRM1)和小亚基核苷酸还原酶M2(ribonucleoside reductase subunit M2RRM2)组成。近年来,国外关于吉西他滨敏感性的研究逐渐增多,hENT-1, DCK, RRM1和RRM2等几种吉西他滨代谢相关的基因也各有报道,但关于这几种基因能否预测胰腺癌患者吉西他滨辅助化疗的敏感性,结论尚有争议,不能对临床产生较大的指导意义。并且到目前为止,还没有关于中国胰腺癌人群的大宗报道。本课题拟回顾性分析我院2005.1月到2011.6月期间收治的胰腺癌术后患者,其hENT-1, DCK, RRM1和RRM2表达与吉西他滨辅助化疗敏感性的关系,为其应用于临床提供证据。方法一、病人的筛选及病例资料的收集和总结我们收集了从2005.1月到2011.6月我院收治的所有病理确诊为胰腺导管腺癌的行肿瘤切除术病人的临床资料。剔除接受新辅助化疗、放化疗、非吉西他滨化疗、R2切除的病人及术后1月内死亡、随访信息不全的病例,共筛选出102例病人,其中45例术后未行化疗,为非化疗组(对照组),57例术后行至少3个周期的吉西他滨或GEMOX(吉西他滨+奥沙利铂)方案的化疗,为化疗组(实验组)。两组性别,年龄,手术方式,Rx(R0或R1)切除,临床分期,病理分级,肿瘤大小等临床指标相匹配,无统计学差异(P>0.05)。设立对照组,以期排除hENT-1, DCK, RRM1, RRM2基因的表达本身即为胰腺癌术后患者的独立预后因素的可能,进而证明其仅在吉西他滨辅助化疗的患者中发挥作用。二：免疫组化及结果评级我们收集了此102例病人的福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织蜡块,HE染色的切片用来确认病理类型为胰腺导管腺癌。组织蜡块切成小于4um厚度的连续切片,做hENT-1, DCK, RRM1, RRM2的蛋白免疫组化。并由本人与本院病理科程润芬医生分别评级。结合双方的组化评级结果,评分不一致的请本院病理科孙燕副主任医师评定。三：QRT-PCR及结果计算102例胰腺癌病人中可收集到53例病人的新鲜冰冻肿瘤组织,其中化疗组24人,非化疗组29人。两组性别,年龄,手术方式,Rx(R0或R1)切除,临床分期,病理分级,肿瘤大小等临床指标相匹配,无统计学差异(P>0.05)。我们采用RNA提取试剂盒从这53例病人的新鲜冰冻肿瘤组织中提取全RNA,反转录并用QRT-PCR验证hENT-1, DCK, RRM1, RRM2在mRNA水平表达与吉西他滨化疗敏感性的关系。四：结果分析在化疗组和非化疗组中分别分析hENT-1, DCK, RRM1, RRM2四个基因在蛋白组化水平及mRNA水平与患者OS和DFS的关系。结果一：蛋白水平1.患者总生存期(OS)分析非化疗组中,RRM1蛋白表达为患者OS的独立相关因素。RRM1蛋白高表达组生存期较高,这与相关文献报道一致。化疗组中,RRM2, hENT-1的蛋白表达是患者OS的独立相关因素。RRM2低表达组、hENT-1高表达组分别拥有较长的OS。2.患者无瘤生存期(DFS)分析非化疗组中,RRM1的蛋白表达为患者DFS的独立相关因素。RRM1蛋白高表达组的患者DFS较长。化疗组中,RRM2, hENT-1的蛋白表达为患者DFS的独立相关因素。RRM2低表达组、hENT-1高表达组分别拥有较长的DFS。二：mRNA水平1.患者总生存期(OS)分析两组中,hENT-1, DCK, RRM1, RRM2的mRNA表达均非患者OS的独立相关因素。化疗组中,hENT-1mRNA高表达组的生存期较长,但达不到统计学差异(P=0.091)。2.患者无瘤生存期(DFS)分析非化疗组中,hENT-1, DCK, RRM1, RRM2的mRNA表达均非患者DFS的独立相关因素。化疗组中,]hENT-1mRNA的表达为患者DFS的独立相关因素。结论RRM2, hENT-1的蛋白水平的表达是吉西他滨辅助化疗患者DFS和OS的独立相关因素,RRM2低表达组、hENT-1高表达组分别拥有较长的DFS和OS。在mRNA水平,仅hENT-1为吉西他滨辅助化疗患者DFS的独立相关因素。RRM2, hENT-1免疫组化染色的方法,操作简单,灵敏度高,重复性强,有望成为预测胰腺癌患者术后吉西他滨辅助化疗敏感性的重要方法。